盧葵花，徐俊杰，胡 鑫

(1．湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2．湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院)

食管癌是我國最常見且嚴(yán)重影響人民健康水平的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于胃癌[1-2]。早期食管癌手術(shù)切除后5年生存率高，患者預(yù)后良好，而中晚期食管癌術(shù)后5年生存率低于10%，患者預(yù)后差[3-4]。迄今，食管癌的診斷方法仍以細(xì)胞學(xué)檢查和內(nèi)鏡檢查為主，但其靈敏度和特異性欠佳[5]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)有關(guān)食管癌早期診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志物作了大量的研究，如腫瘤標(biāo)志物P53、COX、VEGF、Fascin等，但食管癌的發(fā)生機(jī)制尚不明確，眾多標(biāo)記物的敏感性、特異性還有待提高[6-9]。研究表明，上皮特異性ETS轉(zhuǎn)錄因子3(ESE3)在食管鱗狀上皮和食管鱗狀細(xì)胞癌中都有表達(dá)，ESE3蛋白在正常食管鱗狀上皮定位于細(xì)胞核，在異型增生及癌變的食管上皮中出現(xiàn)異常胞質(zhì)定位[10]。因此，血清ESE3有可能成為食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的血清學(xué)指標(biāo)。本研究探討ESE3蛋白檢測在食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷中的作用，旨在尋找食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷特異性強(qiáng)、敏感性高的血清學(xué)標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集于湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院和湖北省腫瘤醫(yī)院消化科和消化內(nèi)鏡中心就診，且診斷為食管鱗狀細(xì)胞病變的患者87例，均于病理科留存食管病變樣本和血清標(biāo)本，按病理診斷結(jié)果分為食管輕度異型增生12例、中度異型增生13例、重度異型增生15例、早期食管鱗狀細(xì)胞癌26例(均為原位癌)、進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌21例；患者年齡45～81歲；男61例，女26例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷為食管異型增生或食管鱗狀細(xì)胞癌者；②入組前未接受放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷為食管腺癌患者；②有其他部位惡性腫瘤患者；③臨床資料不完整者。同時(shí)選取10例正常鱗狀上皮作為對(duì)照，同樣留取對(duì)應(yīng)的血清標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色

①切片：對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行4μm連續(xù)切片；②脫蠟水化：將切片依次放入二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中脫蠟，各15min，將脫蠟后的切片按順序放入梯度酒精溶液中進(jìn)行脫水，經(jīng)脫蠟水化后，漂洗、加用血清封閉；③雜交：加一抗4℃冰箱孵育過夜，漂洗、甩干，滴加二抗室溫孵育30min；④染色：洗去二抗，滴加DAB顯色，清水沖洗，蘇木精復(fù)染1min，流水沖洗5min，梯度酒精脫水，封片、閱片；⑤結(jié)果判讀[11]：將ESE3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中呈棕色評(píng)定為陽性，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，其中細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無色記作0分，淡黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分；陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：陰性記作0分，陽性細(xì)胞≤10%記作1分，陽性細(xì)胞11%～50%記作2分，陽性細(xì)胞51%～75%記作3分，陽性細(xì)胞>75%記作4分；最終染色評(píng)分結(jié)果為細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積，對(duì)5個(gè)隨機(jī)視野的評(píng)價(jià)結(jié)果取平均值作為最終ESE3蛋白陽性率的結(jié)果。

1.2.2 ELISA方法檢測

ESE3 ELISA試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，具有高效、靈敏、特異的抗體，具體檢測步驟如下：①標(biāo)準(zhǔn)品稀釋與加樣：收集各樣品血清，在酶標(biāo)板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，將樣品懸空加入酶標(biāo)板底部，輕輕混勻；②溫?。河梅獍迥みM(jìn)行封板，37°C 30min；③洗滌：甩干，每孔加洗滌液200μL，靜置30s棄液，重復(fù)5次，充分甩干液體；④加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL；⑤溫浴、洗滌：操作同上；⑥顯色：每孔加入顯色劑A液50μL，顯色劑B液50μL，輕輕混勻，37°C避光顯色15min；⑦終止、測定：每孔加入終止液50μL，測定各孔吸光度。

1.2.3 各級(jí)異型增生食管、早期食管鱗狀細(xì)胞癌、進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌分組方法

對(duì)各組食管黏膜組織進(jìn)行碘染色內(nèi)鏡檢查，由于異常鱗狀上皮細(xì)胞中糖原含量減少或者消失，遇碘之后染色較淺或者不染色，故各級(jí)異型增生食管黏膜著色介于淺染與不染之間，表現(xiàn)為程度不同的淡染或者不染，輕度、中度和重度異型增生著色依次減弱；食管鱗狀細(xì)胞癌中出現(xiàn)斑禿樣、地圖狀不著色區(qū)域，邊緣與染色深的背景分界清楚可辨，進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌呈現(xiàn)多發(fā)或者主病灶延伸的不染色部位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ESE3蛋白在食管病變各階段的免疫組化染色情況比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，正常鱗狀上皮細(xì)胞質(zhì)中幾乎無ESE3蛋白陽性表達(dá)；ESE3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌各階段均有陽性表達(dá)。ESE3在輕度異型增生中陽性表達(dá)率為16.67%(2/12)，少部分定位于細(xì)胞質(zhì)；在中度異型增生中陽性表達(dá)率有所升高，為23.08%(3/13)，一部分定位于細(xì)胞質(zhì)；而在重度異型增生中陽性表達(dá)率為33.33%(5/15)，絕大部分定位于細(xì)胞質(zhì)；在早期食管鱗狀細(xì)胞癌以及進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌中幾乎完全定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)率分別為53.85%(14/26)、61.90%(13/21)，異型增生各組陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.03，P>0.05)，但異型增生組織陽性表達(dá)率與食管鱗狀細(xì)胞癌組織陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1(封二)。

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌各階段血清ESE3蛋白水平比較

ELISA結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌各階段血清ESE3蛋白水平為食管輕度異型增生<中度異型增生<重度異型增生<早期食管鱗狀細(xì)胞癌<進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌各個(gè)發(fā)生發(fā)展階段血清

2.3 血清ESE3蛋白水平與食管鱗狀細(xì)胞癌不同階段的Spearman相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清ESE3蛋白水平與食管鱗狀細(xì)胞癌不同階段呈顯著正相關(guān)(r=0.307，P<0.05)。

2.4 血清ESE3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷價(jià)值

血清ESE3檢測食管鱗狀細(xì)胞癌的AUC為0.838(95%CI：0.750～0.926)，最佳截取值為552.15pg/mL，此值時(shí)敏感度為93.60%，特異度為70.00%，見圖2。

圖2 血清ESE3診斷食管鱗的ROC曲線

3 討 論

食管鱗狀細(xì)胞癌是一種具有高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤疾病，其早期診斷率低，食管鱗狀細(xì)胞癌每年可致高達(dá)15萬人死亡[12-13]。食管鱗狀細(xì)胞癌的組織病理類型包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌兩種，在我國食管鱗狀細(xì)胞癌約占全部食管癌90%以上[14]，由于早期缺乏特異性癥狀，多數(shù)食管鱗狀細(xì)胞癌患者確診時(shí)已處于腫瘤中晚期[15]。盡管近年來各種消化內(nèi)鏡技術(shù)不斷發(fā)展，但患者5年生存率仍較低，給其家庭以及社會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)壓力[16]，而血清檢查具有無創(chuàng)、簡捷、費(fèi)用相對(duì)較低等特點(diǎn)，因此，尋找能夠早期診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的血清檢測指標(biāo)具有重要意義。

ETS是轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的家族之一，上皮組織特異性表達(dá)的ETS基因又被簡稱為ESE基因，包括ESE1、ESE2和ESE3，主要表達(dá)于上皮組織和上皮來源細(xì)胞，參與調(diào)控細(xì)胞分化與增殖[17]。既往文獻(xiàn)[18]研究表明，ESE3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其在上皮組織中表達(dá)下調(diào)會(huì)影響上皮細(xì)胞正常分化過程。報(bào)道顯示[19-22]，ESE3在前列腺癌、胰腺癌中缺失表達(dá)，并作為潛在的抑癌基因發(fā)揮作用，但其在卵巢癌以及胃癌中表達(dá)升高，可作為卵巢癌預(yù)后不良的診斷指標(biāo)。Li等[10]發(fā)現(xiàn)ESE3的核定位可以通過其過表達(dá)來恢復(fù)，ESE3重新定位可能是食管鱗狀上皮癌變的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，正常鱗狀上皮細(xì)胞質(zhì)中幾乎無ESE3蛋白陽性表達(dá)，ESE3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌各個(gè)發(fā)生發(fā)展階段均有陽性表達(dá)，其在輕度異型增生、中度異型增生、重度異型增生組織中陽性表達(dá)率依次為16.67%、23.08%、33.33%，各種異型增生類型組織中陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但定位于細(xì)胞核數(shù)量逐漸減少，定位于細(xì)胞質(zhì)數(shù)量逐漸增多；在早期食管鱗狀細(xì)胞癌以及進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率分別為53.85%、61.90%，幾乎完全定位于細(xì)胞質(zhì)，且食管鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于異型增生組織中陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明ESE3可能參與了食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展過程。ESE3在正常鱗狀上皮細(xì)胞核中表達(dá)，但定位于食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞質(zhì)中，其從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移可能與細(xì)胞核輸出系統(tǒng)飽和以及變性蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)。同時(shí)，血清ESE3蛋白在食管輕度異型增生、中度異型增生、重度異型增生、早期食管鱗狀細(xì)胞癌以及進(jìn)展期食管鱗狀細(xì)胞癌各個(gè)發(fā)生發(fā)展階段的蛋白水平依次逐漸升高，表明ESE3蛋白在異型增生以及癌變的食管上皮中出現(xiàn)異常胞質(zhì)定位，可能造成ESE3蛋白被外泌到胞外，導(dǎo)致血清中ESE3含量升高，其亞細(xì)胞的改變可能導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生。因此，ESE3蛋白的異常胞質(zhì)定位可能是食管鱗狀細(xì)胞癌癌變過程中的早期事件。

基因表達(dá)是一個(gè)多角度、多層次的調(diào)控過程，ESE3作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在前列腺癌、胰腺癌中起著抑癌基因的作用，并被啟動(dòng)子甲基化沉默，而在胃癌、乳腺癌以及結(jié)腸癌等中過度表達(dá)，并提示不良預(yù)后。本文研究結(jié)果還顯示，Spearman相關(guān)分析表明，血清ESE3蛋白水平與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生階段呈顯著正相關(guān)，表明血清ESE3蛋白水平越高，食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。故ESE3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的角色，檢測其表達(dá)有可能對(duì)評(píng)估食管鱗狀細(xì)胞癌癌前病變的演變發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清ESE3檢測食管鱗狀細(xì)胞癌的AUC為0.838，敏感度為93.60%，特異度為70.00%，表明ESE3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌有一定的診斷價(jià)值，其敏感性較高，但特異度稍差，作為診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的獨(dú)立血清學(xué)指標(biāo)可能還存在缺陷，但用于輔助診斷食管鱗狀細(xì)胞癌具有重要的意義。報(bào)道表明[23]，ESE3通過抑制調(diào)控半胱天冬酶3(caspase3)及其活性參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過程，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。ESE3在胃癌中可能通過激活受體絡(luò)氨酸激酶家族分子EGFR/HER等分子促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[22]。ESE3在食管癌細(xì)胞系中過表達(dá)后，入核數(shù)量明顯增多，進(jìn)而削弱了其對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力[24]。亦有研究[25]顯示，ESE1蛋白在正常食管黏膜、癌旁非典型增生以及食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率依次升高，其異常表達(dá)與食管上皮癌變有關(guān)。但有關(guān)ESE3在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)生過程中的分子作用機(jī)制研究較少，我們推測ESE3蛋白的重新定位可能在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲中發(fā)揮作用，有可能是食管鱗狀細(xì)胞癌變的新機(jī)制。但本文研究尚且存在不足之處，各組收集的病例數(shù)量過少，容易出現(xiàn)一定程度上的結(jié)果偏差，后續(xù)還要增加病例量，開展多中心研究以提供更多的支持依據(jù)?；贓SE3在不同腫瘤中發(fā)揮出來的作用不盡相同，且國內(nèi)外類似報(bào)道極少，本研究得出的僅為初步研究結(jié)果。故本研究結(jié)論尚需建立基因敲除和過表達(dá)小鼠模型對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行功能研究，其對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌靶基因的具體調(diào)控作用以及分子機(jī)制有待詳細(xì)闡明。

綜上所述，ESE3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)顯著上調(diào)，并與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可為食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷、預(yù)防以及治療提供科學(xué)根據(jù)。