余咸靜

(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院，四川 成都 410041)

結(jié)直腸癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)中動(dòng)物高蛋白比重的增加，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生可能與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及組織微環(huán)境中免疫狀態(tài)有關(guān)，腫瘤微環(huán)境是一個(gè)由免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的綜合系統(tǒng)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，相對(duì)于外周血中免疫狀態(tài)，腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)更能準(zhǔn)確表達(dá)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)[2-3]。所以本研究旨在檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中癌細(xì)胞凋亡情況，T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)等免疫細(xì)胞凋亡及浸潤(rùn)程度，分析結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與免疫細(xì)胞凋亡及浸潤(rùn)程度的關(guān)系，了解微環(huán)境免疫細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌惡化的重要性，為結(jié)直腸癌治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年4月至2019年4月期間本院收集的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本92例，包括結(jié)直腸癌組織、癌旁組織(避開(kāi)壞死區(qū)，距離癌結(jié)節(jié)邊緣2cm以上的結(jié)直腸組織)。男53例，女39例；年齡45～75歲，平均(58.17±6.48)歲；右半結(jié)腸癌27例，左半結(jié)腸癌35例，直腸癌30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)直腸癌組織、癌旁組織標(biāo)本來(lái)源于經(jīng)手術(shù)治療的患者，經(jīng)病理檢查證實(shí)為結(jié)直腸癌；②結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療；③組織標(biāo)本的獲取和使用均獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。排除合并其他惡性腫瘤者。

1.2 主要試劑

鼠抗人CD3單抗、鼠抗人CD56單抗、鼠抗人CD21單抗均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 結(jié)直腸癌微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的檢測(cè)

采用免疫組化SP法對(duì)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞進(jìn)行染色。石蠟切片厚度約為4μm，37℃烤箱放置過(guò)夜，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、0.3%過(guò)氧化氫滅活、抗原修復(fù)后，加入鼠抗人CD3單抗(標(biāo)記T細(xì)胞)、鼠抗人CD56單抗(標(biāo)記NK細(xì)胞)或鼠抗人CD21單抗(標(biāo)記DC細(xì)胞)4℃孵育12h，PBS洗滌3次后，加入生物素化標(biāo)記的二抗孵育1h。PBS清洗3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素孵育0.5h，最后采用DAB顯色，細(xì)胞核采用蘇木精復(fù)染，脫水后封片。

T細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)被染為棕黃色者視作陽(yáng)性細(xì)胞，先在100倍鏡下尋找到癌細(xì)胞密集區(qū)，然后在200倍鏡下選取25個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)T細(xì)胞總數(shù)以表示結(jié)直腸癌微環(huán)境中T細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

NK細(xì)胞、DC細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色者視作陽(yáng)性細(xì)胞，先在100倍鏡下尋找到癌細(xì)胞密集區(qū)，然后在200倍鏡下選取50個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)以表示結(jié)直腸癌微環(huán)境中NK細(xì)胞、DC細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

1.3.2 細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)

采用凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞。石蠟切片厚度約為4μm，37℃烤箱放置過(guò)夜，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，加入蛋白酶K工作液反應(yīng)20min，0.3%過(guò)氧化氫滅活10min。然后加入TUNEL反應(yīng)液，在濕盒內(nèi)4℃孵育60min，再加入抗熒光素抗體，室溫下孵育30min。最后采用DAB顯色，細(xì)胞核采用蘇木精復(fù)染，脫水后封片。

凋亡細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核被染為棕黃色者視作陽(yáng)性細(xì)胞。在100倍鏡下尋找到癌細(xì)胞密集區(qū)，在400倍鏡下選取10個(gè)視野，觀察結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡情況。在100倍鏡下尋找到間質(zhì)內(nèi)免疫細(xì)胞聚集區(qū)，400倍鏡下選取10個(gè)視野，觀察免疫細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡水平以凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)評(píng)價(jià)，AI為100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞比例[4]。由于TUNEL染色后，T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等免疫細(xì)胞無(wú)法區(qū)分，所以將T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞作為整體計(jì)算腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的AI。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌及癌旁組織微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度比較

結(jié)直腸癌組織T細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC細(xì)胞浸潤(rùn)程度均低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1～3(封三)。

表1 結(jié)直腸癌及癌旁組織微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度個(gè))

2.2 結(jié)直腸癌及癌旁組織微環(huán)境細(xì)胞凋亡情況比較

結(jié)直腸癌組織TIL細(xì)胞AI高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌及癌旁組織微環(huán)境細(xì)胞凋亡情況指數(shù)

2.3 結(jié)直腸癌微環(huán)境中癌細(xì)胞凋亡與TIL細(xì)胞凋亡關(guān)系分析

通過(guò)表2，采用Pearson分析，得出結(jié)直腸癌細(xì)胞AI與TIL細(xì)胞AI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.559，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與TIL細(xì)胞凋亡的關(guān)系

2.4 結(jié)直腸癌微環(huán)境中癌細(xì)胞凋亡與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度關(guān)系分析

通過(guò)表1，采用Pearson分析，得出結(jié)直腸癌細(xì)胞AI與T細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)(r=0.579，P<0.05)，結(jié)直腸癌細(xì)胞AI與NK細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)(r=0.614，P<0.05)，結(jié)直腸癌細(xì)胞AI與DC細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)(r=0.625，P<0.05),見(jiàn)圖5～7。

圖5 結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與T細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

圖6 結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與NK細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

圖7 結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與DC細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)展與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)控、機(jī)體免疫功能較低等關(guān)系密切。機(jī)體免疫功能低下時(shí)，癌細(xì)胞相對(duì)活躍，可促進(jìn)機(jī)體腫瘤形成，而腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也會(huì)反過(guò)來(lái)影響機(jī)體免疫功能，抑制免疫細(xì)胞殺傷功能，所以機(jī)體免疫功能與腫瘤細(xì)胞之間存在相互制約、互為因果的關(guān)系[5-7]。機(jī)體免疫方式包括細(xì)胞免疫和體液免疫，腫瘤形成后，細(xì)胞免疫是主要發(fā)揮抗腫瘤作用的免疫方式，體液免疫僅起到輔助作用[8]。

T細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC細(xì)胞均參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)。T細(xì)胞包括CD4分子和CD8分子，CD4分子結(jié)合MHCⅡ類分子后形成致敏Th1細(xì)胞，能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，CD8分子結(jié)合MHCⅠ類分子后形成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，不僅可分泌干擾素、腫瘤壞死因子，還可與腫瘤表面抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，對(duì)腫瘤細(xì)胞造成特異性殺傷[9]。NK細(xì)胞屬于天然免疫細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤的首要屏障，可在未刺激狀態(tài)下殺傷腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞數(shù)量與機(jī)體免疫功能、抗腫瘤作用有關(guān)，許多腫瘤患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞數(shù)量減少、活化受體表達(dá)量降低等現(xiàn)象[10]。DC細(xì)胞為功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，其主要作用是將腫瘤細(xì)胞表面抗原及其代謝產(chǎn)物提呈給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，起到殺傷腫瘤細(xì)胞作用[11]。

既往關(guān)于惡性腫瘤患者免疫功能的研究主要集中在外周血免疫細(xì)胞的變化分析，趙美淇等[12]采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)中的T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的表達(dá)水平，對(duì)腫瘤早期發(fā)現(xiàn)和早診斷有指導(dǎo)意義。近些年來(lái)，人們將關(guān)注點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞與腫瘤發(fā)展的關(guān)系上。而本研究采用免疫組化、TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織T細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC細(xì)胞浸潤(rùn)程度及TIL細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織T細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著低于癌旁組織，TIL細(xì)胞AI明顯高于癌旁組織(P均<0.05)，提示結(jié)直腸癌細(xì)胞可能對(duì)微環(huán)境免疫細(xì)胞具有抑制作用。為了進(jìn)一步明確結(jié)直腸癌細(xì)胞與微環(huán)境免疫細(xì)胞的關(guān)系，本研究經(jīng)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞AI與T細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC細(xì)胞浸潤(rùn)程度均呈明顯正相關(guān)，與TIL細(xì)胞AI呈明顯負(fù)相關(guān)，提示結(jié)直腸癌細(xì)胞與微環(huán)境免疫細(xì)胞相互影響。Karki等[13]研究認(rèn)為結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡減弱是結(jié)直腸癌發(fā)展的機(jī)制之一，并且有許多研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)直腸腫瘤發(fā)展[14-16]。由于細(xì)胞本身及環(huán)境因素均會(huì)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞可通過(guò)穿孔或Fas途徑誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞也可通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫監(jiān)控，引起免疫數(shù)量減少，DC細(xì)胞提呈腫瘤抗原能力減弱，初始T細(xì)胞活化受到抑制。Shimoyama等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸腺瘤相比，結(jié)直腸癌Fas配體陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，認(rèn)為Fas配體異常表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)展有關(guān)。而有研究[18]在肝癌等其他惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，肝癌組患者基于Fas/Fasl途徑的T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯增加，認(rèn)為肝癌細(xì)胞出現(xiàn)免疫逃逸與其上調(diào)Fas配體表達(dá)引起T淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)。T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞在激活后均表達(dá)Fas受體，所以推測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞可能會(huì)通過(guò)上調(diào)Fas配體，經(jīng)Fas/Fasl途徑誘導(dǎo)上述免疫細(xì)胞凋亡。

總而言之，結(jié)直腸癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞狀態(tài)能直接反映機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度、凋亡水平與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡水平有關(guān)，消除結(jié)直腸癌微環(huán)境中對(duì)免疫細(xì)胞的不利因素，可能會(huì)抑制結(jié)腸癌進(jìn)一步惡化，這也為臨床開(kāi)發(fā)免疫治療方法提供指導(dǎo)作用。