郭春蘭，鐘秉知，劉建春，王 青，姜維佳，宋麗娟，張紅珍，3

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床學(xué)院，山西 晉中030619；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 咸陽712100；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)生物學(xué)研究中心，國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室，山西 晉中 030619）

隨著生活水平的不斷提高，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）在我國也逐漸成為死亡的重要因素，嚴(yán)重危害人類健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞激活與損傷、內(nèi)膜下脂質(zhì)的沉積與泡沫細(xì)胞的形成、血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖和遷移是AS 形成的主要環(huán)節(jié)［1-2］。中醫(yī)學(xué)沒有動(dòng)脈硬化的記載，根據(jù)相似癥候群的描述，認(rèn)為氣虛、血瘀、痰凝為發(fā)病的主要病機(jī)，本虛標(biāo)實(shí)是AS 的基本特征，氣虛血瘀證為AS 辨證論治常見證型，益氣活血能明顯改善臨床癥狀［3-4］。研究報(bào)道，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成及進(jìn)展，參與多種細(xì)胞因子及平滑肌的增殖［5］。本研究觀察補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠主動(dòng)脈組織NF-κB p65mRNA 的表達(dá)量以及NF-κB p65 蛋白表達(dá)量的影響，進(jìn)一步探討NF-κB p65 在AS 的形成過程發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60只，7 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為20～23 ℃，濕度60%，環(huán)境安靜，通風(fēng)良好。所涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究的有關(guān)材料以及臨床取材，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.1.2 藥物與試劑 實(shí)驗(yàn)藥物：棉芪30 g，川芎6 g，當(dāng)歸6 g，桃仁3 g，赤芍6 g，環(huán)毛蚓3 g，紅花3 g。按以上比例配置濃縮，調(diào)至含藥量2 g/mL，分裝滅菌，100 mL/瓶。放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：Trizol 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒（批號(hào)SK2445）、定量PCR 試劑：SG Fast qPCR Master Mix（High Rox）（2X）（BBI），由上海生工生物工程股份有限公司提供。ROCK 激酶（Sigma，批號(hào)R1281），血管緊張素II（Sigma，批號(hào)A9525），Y27632 抑制劑（Sigma，批號(hào)Y0503）。大鼠血管平滑肌細(xì)胞株A10（ATCC，批號(hào)CRL1476）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AS 模型制作 參照經(jīng)典的動(dòng)脈粥樣硬化造模方法［6］，將30 只造模大鼠按60 萬U/kg 的劑量一次性給予維生素D3 腹腔注射，隨后每天喂服高脂飼料（81.3%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%白糖、3%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉），連續(xù)喂服45 d，隨機(jī)抽取4 只大鼠檢測主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)，符合動(dòng)脈粥樣硬化特征。

1.2.2 含藥血清制備 根據(jù)體表面積法計(jì)算大鼠相當(dāng)于成人的臨床等效劑量，以此劑量作為補(bǔ)陽還五湯低劑量對(duì)照組的灌胃劑量［10 g/（kg·d）］，并按此比例設(shè)定補(bǔ)陽還五湯高劑量對(duì)照組的灌胃劑量［20 g/（kg·d）］。取正常SD 大鼠30 只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A 組）10 只、補(bǔ)陽還五湯低劑量對(duì)照組（B 組）10 只、補(bǔ)陽還五湯高劑量對(duì)照組（C 組）10只。另取AS 模型大鼠30 只，隨機(jī)均分為AS 模型組（D 組）10 只、補(bǔ)陽還五湯低劑量治療組（E組）10 只、補(bǔ)陽還五湯高劑量治療組（F 組）10 只。A組、D 組每日給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃10 d。第10 天（藥物血清已穩(wěn)定，達(dá)到平臺(tái)期）禁食不禁水2 h 后，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，靜置、離心、取血清，同組混勻，56 ℃，30 min 滅活，過濾除菌后，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前將血清用DMEM-F12 培養(yǎng)基均配成10%（為前期實(shí)驗(yàn)得出的最適濃度）的藥物血清溶液，過濾除菌后分裝，4 ℃保存?zhèn)溆?，作為相?duì)應(yīng)的含藥血清。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 取生長狀態(tài)良好的第10 代血管平滑肌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，并制備細(xì)胞懸液，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板中，放置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后，將培養(yǎng)基換成對(duì)應(yīng)的含藥血清（A、B、C、D、E、F 共6 種血清），每種血清隨機(jī)分為4 組，空白對(duì)照組：加入含10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)液；陽性對(duì)照組：加入Rho 激酶（1×10-10mol/L）的DMEM-F12 培養(yǎng)液；ROCK 激動(dòng)劑組：加入AngII（Rho 激酶激動(dòng)劑，1×10-9mol/L）的DMEM-F12 培養(yǎng)液；ROCK 抑制劑組：加入Y-27632（Rho 激酶抑制劑，1×10-6mol/L）的DMEM-F12 培養(yǎng)液。放置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.4 平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 mRNA 的檢測 稱取大鼠主動(dòng)脈組織標(biāo)本50 mg，按Trizol 試劑盒說明操作，測定RNA 的質(zhì)量和RNA 的完整性，調(diào)節(jié)標(biāo)本總RNA 濃度至50 mg/L，-70 ℃冰箱中保存樣本RNA。按照試劑說明書進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄及PCR 反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后獲取循環(huán)閾值（Ct 值），采用Excel 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白表達(dá)的測定采用Western Blot 方法進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 NF-κB p65mRNA 在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)

各AS 模型組含藥血清作用后NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.001，P＜0.01）。與AS 模型組相比，ROCK 激動(dòng)劑組、空白對(duì)照組的補(bǔ)陽還五湯低劑量治療組含藥血清作用后NFκB p65mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001）；陽性對(duì)照組的補(bǔ)陽還五湯低劑量治療組含藥血清作用后NF-κB p65mRNA 的表達(dá)水平降低（P＜0.05）；陽性對(duì)照組、ROCK 激動(dòng)劑組的補(bǔ)陽還五湯高劑量治療組含藥血清作用后NF-κB p65mRNA 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001）；空白對(duì)照組、ROCK抑制劑組的補(bǔ)陽還五湯高劑量治療組含藥血清作用后NF-κB p65mRNA 的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 不同含藥血清對(duì)血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65mRNA 表達(dá)的影響

2.2 不同干預(yù)組NF-κB p65 蛋白的表達(dá)

2.2.1 陽性對(duì)照組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，AS 模型組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；補(bǔ)陽還五湯高劑量對(duì)照組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與AS 模型組相比，補(bǔ)陽還五湯低劑量、高劑量治療組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 陽性對(duì)照組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)的Western Blot 檢測結(jié)果

2.2.2 ROCK 激動(dòng)劑組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，AS 模型組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與AS 模型組相比，補(bǔ)陽還五湯高劑量治療組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 ROCK 激動(dòng)劑組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白表達(dá)的Western Blot 檢測結(jié)果

2.2.3 空白對(duì)照組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，AS 模型組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；補(bǔ)陽還五湯低劑量、高劑量對(duì)照組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001）。與AS 模型組相比，補(bǔ)陽還五湯低劑量、高劑量治療組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001）。結(jié)果見圖4。

圖4 空白對(duì)照組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白表達(dá)的Western Blot 檢測結(jié)果

2.2.4 ROCK 抑制劑組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白的表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，AS 模型組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與AS 模型組比較，補(bǔ)陽還五湯高、低劑量治療組含藥血清作用后NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖5。

圖5 ROCK 抑制劑組血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白表達(dá)的Western Blot 檢測結(jié)果

3 討論

AS 的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理變化過程，主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，ECs）受損，細(xì)胞黏著分子（cell adhesion molecule，CAM）異常表達(dá)，白細(xì)胞黏附及遷移，平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）增殖和遷移，泡沫細(xì)胞形成，纖維組織增生等病理過程，形成粥樣斑塊［7-8］。

大量研究顯示，Rho 激酶參與機(jī)體多種生物過程，包括對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性和遷移的增加，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，與AS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-10］。

NF-κB 是參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等病理生理過程，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，同時(shí)參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。研究報(bào)道NF-κB 在AS 形成中發(fā)揮著重要的作用，參與泡沫細(xì)胞形成、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖、血管炎癥、動(dòng)脈鈣化和斑塊進(jìn)展等多種病理過程［5］。活化的NF-κB 存在于AS 病灶的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中，對(duì)促炎細(xì)胞因子、生長因子、黏附分子、趨化因子等基因的表達(dá)可以起到調(diào)節(jié)編碼的作用。

前期研究表明，補(bǔ)陽還五湯對(duì)主動(dòng)脈的超微損傷有明顯的治療和預(yù)防作用［11-12］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上將不同濃度的補(bǔ)陽還五湯給SD正常大鼠及AS 模型大鼠灌胃，制備含藥血清，將體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞用不同濃度的含藥血清保護(hù)后，分別加入Rho 激酶抑制劑、Rho 激酶激動(dòng)劑、Rho 激酶，通過PCR 法檢測各組含藥血清對(duì)血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 mRNA 含量的影響，通過Western Blot 法檢測各組含藥血清對(duì)血管平滑肌細(xì)胞NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示各組補(bǔ)陽還五湯高劑量治療組NF-κB p65 mRNA 含量、NF-κB p65 蛋白的表達(dá)均低于AS模型組，表明補(bǔ)陽還五湯具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞能夠起到保護(hù)作用，從而抑制AS 病變的形成和進(jìn)展，防治動(dòng)脈粥樣硬化。這一過程可能與其下調(diào)NF-κB p65mRNA、NF-κB p65 蛋白的表達(dá)有關(guān)。當(dāng)然，動(dòng)脈硬化是一個(gè)多因素影響的病理結(jié)果，對(duì)NF-κB p65mRNA、NF-κB p65 蛋白表達(dá)的下調(diào)可能是補(bǔ)陽還五湯抗AS 作用機(jī)制之一，為中醫(yī)藥全面認(rèn)識(shí)動(dòng)脈粥樣硬化提供了依據(jù)，進(jìn)而為臨床上防治動(dòng)脈粥樣硬化提供新的思路。