米 洋，鄧 虎，趙克明

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng)110847； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

哮喘是一種以異質(zhì)性為主要特征的慢性炎癥性氣道疾?。?］，由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種炎性介質(zhì)參與［2］，隨著生活壓力、環(huán)境、飼養(yǎng)寵物增多，其發(fā)病率和死亡率逐年升高［3-4］，吸入性和口服皮質(zhì)類固醇藥物常常作為緩解哮喘發(fā)作以及治療的首選藥物［5］。近年來(lái)，隨著中醫(yī)事業(yè)的發(fā)展以及人們對(duì)中醫(yī)藥的認(rèn)可，中醫(yī)藥治療受到廣泛關(guān)注?！秱摗吩疲骸把鯕獗M，腠理開，邪氣因入，與正氣相搏，結(jié)于脅下，正邪分爭(zhēng)，往來(lái)寒熱，休作有時(shí)，小柴胡湯主之”“傷寒五六日，中風(fēng)，往來(lái)寒熱，胸脅苦滿，嘿嘿不欲飲食，心煩喜嘔，或胸中煩而不嘔，或渴，或腹中痛，或脅下痞硬，或心下悸，小便不利，或不渴，身有微熱，或咳者，小柴胡湯主之”。哮喘最常于夜間發(fā)作，以干咳為主，這些表現(xiàn)都與條文中提到的小柴胡湯主癥相合。有臨床觀察表明，小柴胡湯能夠降低哮喘的復(fù)發(fā)率［6］。本研究將通過(guò)觀察氣道壁嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度以及TGF-β1/Smad3 信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)氣道重塑的影響，探究加味小柴胡湯在支氣管哮喘發(fā)作中的作用，為中藥應(yīng)用于臨床支氣管哮喘的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠36只，6～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 遼2019-0001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度42%～45%。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，同意實(shí)施。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加味小柴胡湯由黃芩15 g，柴胡15 g，法半夏10 g，黨參10 g，甘草10 g，炙麻黃5 g，炒杏仁10 g，紫蘇子10 g，大棗15 g 組成，藥物飲片購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診，分別煎煮成生藥含量0.9 g/mL（低劑量組）、生藥含量為1.8 g/mL（高劑量組）［7］，各自混勻，分裝備用；地塞米松注射液：廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號(hào)：H44022090，使用前將其稀釋為0.18 mg/mL溶液備用。

1.1.3 試劑與儀器 卵蛋白（OVA）：美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)（A8040）；氫氧化鋁購(gòu)自天津化學(xué)試劑三廠。超聲霧化器：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：402AI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模 將36 只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、西藥組，中藥低、高劑量組及中藥聯(lián)合西藥組6 組，每組6 只。

模型制備參照文獻(xiàn)［8］，將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除空白組外，其余各組第1 天和第8 天分多點(diǎn)腹腔注射致敏液（OVA+氫氧化鋁混懸液），使大鼠致敏。第15 天開始將大鼠放入霧化箱中，予以1%OVA 溶液霧化，隔日1 次，10 min/次，連續(xù)霧化4 周。當(dāng)大鼠出現(xiàn)呼吸急促、呼吸困難、站立不穩(wěn)等癥狀時(shí)則為激發(fā)成功。

1.2.2 給藥方法 大鼠模型激發(fā)成功開始，各用藥組分別給予對(duì)應(yīng)藥物進(jìn)行灌胃治療，西藥組給予地塞米松溶液、中藥低劑量組給予生藥含量0.9 g/mL 的加味小柴胡湯溶液、中藥高劑量組給予生藥含量1.8 g/mL 的加味小柴胡湯溶液、中藥聯(lián)合西藥組給予地塞米松聯(lián)合加味小柴胡湯溶液（1.8 g/mL），空白組以及模型組給予用藥組同等劑量的生理鹽水。灌胃治療每日1 次，每次給藥10 mL/kg，給藥時(shí)間為實(shí)驗(yàn)第16～42 天。

1.3 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

將大鼠進(jìn)行解剖，常規(guī)提取肺組織，將部分肺組織置于4%多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行沖洗、透明、浸潤(rùn)、包埋、切片以獲取組織切片。

1.3.1 蘇木精-伊紅HE 染色 取制備好的切片，HE 染色后顯微鏡下觀察肺組織氣道壁嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，運(yùn)用圖像采集系統(tǒng)、Image J 醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定各組肺內(nèi)支氣管壁面積（total bronchial wall area，Wat）、支氣管平滑肌面積（smooth muscle wall area，Wam）。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 組織片脫蠟水化，放入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS 沖洗5 min，滴加正常山羊血清封閉處理，28 ℃放置20 min。加稀釋好的一抗1 滴，4 ℃冰箱12 h；PBS沖洗5 min，加入二抗工作液，37 ℃恒溫水浴鍋90 min，PBS 沖洗5 min。DBA 顯色，蘇木精染色復(fù)染細(xì)胞核30 s～1 min，樹膠封片，曬干。通過(guò)顯色劑標(biāo)記抗體的顏色來(lái)確定抗原（多肽和蛋白質(zhì)）的組織和細(xì)胞，顯微鏡下觀察到棕黃色染色即為陽(yáng)性，從而對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件，連續(xù)型變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組計(jì)量資料采用單因素方差分析，兩組間比較用LSD-t 法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織支氣管病理學(xué)改變

HE 染色后，光鏡下觀察，與空白組比較，模型組及各用藥組肺組織氣道壁嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多，氣道管壁增厚，管腔變窄（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組肺組織氣道壁嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道管壁厚度及管腔寬度均有不同程度降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

2.2 肺組織支氣管嗜酸性粒細(xì)胞及氣道形態(tài)參數(shù)比較

模型組嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、支氣管管壁面積、支氣管平滑肌面積均明顯高于空白組（P＜0.05），各治療組嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、支氣管管壁面積、支氣管平滑肌面積均低于模型組（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠肺組織氣道壁嗜酸性粒細(xì)胞、Wat、Warm 比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織氣道壁嗜酸性粒細(xì)胞、Wat、Warm 比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n EOS Wat（μm2） Wam（μm2）空白組 6 0.33±0.52 23.65±2.85 2.15±0.22模型組 6 9.33±1.861） 54.82±5.961） 5.08±0.451）西藥組 6 5.00±1.261）2） 31.53±3.721）2） 3.10±0.231）2）中藥低劑量組 6 8.00±1.411）2） 42.90±3.341）2） 3.95±0.391）2）中藥高劑量組 6 6.67±1.031）2） 37.77±3.721）2） 3.27±0.271）2）中藥聯(lián)合西藥組 6 3.67±1.211）2） 27.68±3.221）2） 2.57±0.271）2）F 值 38.392 50.036 60.305 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 各組大鼠支氣管肺組織TGF-β1蛋白的顯色反應(yīng)

DBA 顯色成黃色，模型組通過(guò)顯色可見TGFβ1、Smad3 蛋白表達(dá)水平上升，其余用藥組顯色可見TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低。結(jié)果見圖2、圖3。TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)水平計(jì)數(shù)通過(guò)平均光密度來(lái)表達(dá)，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 平均光密度表達(dá) （±s）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3 平均光密度表達(dá) （±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n TGF-β1 Smad3空白組 6 0.11±0.02 0.11±0.02模型組 6 0.3±0.031） 0.3±0.041）西藥組 6 0.19±0.021）2） 0.18±0.011）2）中藥低劑量組 6 0.27±0.021）2） 0.24±0.031）2）中藥高劑量組 6 0.24±0.021）2） 0.22±0.031）2）中藥聯(lián)合西藥組 6 0.14±0.011）2） 0.15±0.021）2）F 值 25.372 39.265 P 值 0.000 0.000

圖2 各組大鼠支氣管肺組織TGF-β1 蛋白的顯色反應(yīng)（免疫組織化學(xué)染色，10×40 倍）

圖3 各組大鼠支氣管肺組織Smad3 蛋白的顯色反應(yīng)（免疫組織化學(xué)染色，10×40 倍）

3 討論

近年來(lái)隨著生活節(jié)奏的加快、生活壓力增大，人們身體素質(zhì)減弱，更有外部大氣環(huán)境污染程度增加，哮喘已成為發(fā)病率快速升高的疾病。哮喘作為一種發(fā)作性疾病，環(huán)境、壓力、感染都能引誘其發(fā)作［9］，但就目前而言支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制仍不詳盡。支氣管哮喘患者受長(zhǎng)期過(guò)敏原、炎癥等刺激出現(xiàn)喘息、咳嗽、胸悶等癥狀，反復(fù)發(fā)作就會(huì)出現(xiàn)可逆性氣流受限，隨著病情進(jìn)展，可致氣道重構(gòu)［10］。

2019 年最新的中國(guó)肺健康研究（CPH）結(jié)果顯示，我國(guó)人群哮喘總體發(fā)病率4.2%，患者人數(shù)達(dá)45 700萬(wàn)［11］。雖然面對(duì)不同嚴(yán)重程度的哮喘，都有相應(yīng)治療藥物，但患者仍然面臨著病情的急性加重以及不可控的風(fēng)險(xiǎn)［12］。

氣道重塑目前被認(rèn)為是哮喘慢性化、持續(xù)化及嚴(yán)重化的病理基礎(chǔ)，治療哮喘必須與防治氣道重塑相結(jié)合，才可能達(dá)到真正意義上的控制［13］。目前研究影響氣道重塑的因素中，TGF-β/Smads 信號(hào)傳導(dǎo)通路受到廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是一種促纖維化細(xì)胞因子［14］，TGF-β 有3 種亞型，其中多個(gè)研究表明，TGF-β1能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分裂增殖、分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化［15-16］，而肌纖維細(xì)胞作為許多肺纖維化疾病中的效應(yīng)細(xì)胞，最終使傷痕組織取代了正常肺實(shí)質(zhì)，減少了氣體交換表面，因而最終致使病人的呼吸能力下降［17］。由此可見，哮喘發(fā)作時(shí)，TGF-β1的表達(dá)程度、支氣管平滑肌面積、支氣管壁面積、嗜酸性細(xì)胞的數(shù)量均為正向表達(dá)。而Smads 作為發(fā)揮作用的下游重要效應(yīng)蛋白，分為多種亞型，Smad3 為受體調(diào)節(jié)型蛋白，研究中其蛋白表達(dá)增加，由此可見Smad3 能夠促進(jìn)氣道重塑。

中醫(yī)學(xué)將支氣管哮喘歸屬于“哮病”范疇，中醫(yī)認(rèn)為哮病的發(fā)生多是因宿痰伏于肺，因外感、飲食、情志、勞累等誘發(fā)，引動(dòng)伏痰，壅塞氣道，肺失宣降，致痰鳴如吼［18］。趙克明等［19］認(rèn)為“少陽(yáng)樞機(jī)失利”也是一個(gè)引起哮喘發(fā)作的重要因素。少陽(yáng)作為氣機(jī)升降之樞紐具有調(diào)暢氣機(jī)的作用，治療可以和解少陽(yáng)、樞利氣機(jī)為主。加味小柴胡湯是在小柴胡湯的基礎(chǔ)上輔以麻黃、杏仁和紫蘇子等降氣平喘的藥物。柴胡作為君藥，黃芩作為臣藥，一透邪一泄熱，二者一升一降，構(gòu)成和解少陽(yáng)的基本理論結(jié)構(gòu)。以人參、大棗益氣健脾，意在扶正以祛邪，再佐以麻黃、杏仁和紫蘇子等降氣平喘之品，使藥效更加顯著。哮喘多由外因引動(dòng)而發(fā)，故人體正氣充盛，抵御外邪能力增強(qiáng)，衛(wèi)外固密，邪無(wú)以入，則病不發(fā)。重視預(yù)防哮喘發(fā)作的重要性，素有哮喘的患者，可以通過(guò)增強(qiáng)自身正氣，避免觸發(fā)哮喘發(fā)作的誘因，保持平和的心態(tài)來(lái)預(yù)防哮喘發(fā)作，做到病未發(fā)而先防。

本研究結(jié)果表明，不論是減輕嗜酸性細(xì)胞的浸潤(rùn)，還是減緩促進(jìn)氣道重塑的TGF-β1、Smad3的表達(dá)，加味小柴胡湯都發(fā)揮其特有的作用。由此可見，加味小柴胡湯可以通過(guò)影響TGF-β1/Smad3 信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)減緩哮喘發(fā)作時(shí)引起的氣道重塑。