李培東，劉慶慶，肖陳城*，陳創(chuàng)夫*,王 丹，依再提古麗·熱依木江，王一帆，朱 雅，王 勇，李亞玲

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.第八師瑪納斯河濕地自然保護(hù)區(qū)管理站，新疆石河子 832000)

禽流感(avian influenza,AI)又稱歐洲雞瘟，屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，于1878年(意大利)初次報(bào)道[1]。禽流感病毒(AIV)根據(jù)其表面蛋白的抗原性已鑒定出16種HA亞型和9種NA亞型，除蝙蝠起源的流感樣病毒H17N10亞型和H18N11亞型外，所有的AIV亞型最初都是在禽類宿主中分離出來的[2]。世界上第1次分離得到AIV是在1901年，而在1955年才確定AIV與人類以及哺乳動(dòng)物流感病毒之間存在著關(guān)聯(lián)，在1970年左右發(fā)現(xiàn)水禽是AIV的基因庫(kù)[3]。自AI被報(bào)道以來，世界上許多國(guó)家和地區(qū)都陸續(xù)發(fā)生了AI的疫情，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至對(duì)人類健康也造成了一定的威脅。

本研究對(duì)2017年采集自新疆艾比湖自然保護(hù)區(qū)野鳥的糞便棉拭子進(jìn)行了AIV的分離與鑒定，從其中一個(gè)棉拭子樣品中分離到了1株野鳥源的H1N2亞型AIV，并對(duì)其進(jìn)行了全基因組的序列分析，旨在調(diào)查野鳥中存在的AIV，為AI的防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑總RNA急速抽提試劑盒購(gòu)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；普通瓊脂糖DNA回收試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pMDTM19-T Vector Cloning Kit、反轉(zhuǎn)錄酶(SMART MMLV Reverse Transcriptase)、dNTP、Permix TaqTM、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa。

1.2 病毒的分離取2017年采集自新疆艾比湖自然保護(hù)區(qū)野鳥的糞便棉拭子100 μL，以注射器注射至9日齡雞胚的絨毛尿囊腔；接種后每日觀察雞胚死亡情況，48 h后收取尿囊液,將收取的尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)初步鑒定。

1.3 提取病毒RNA及反轉(zhuǎn)錄取200 μL雞胚病毒尿囊液，應(yīng)用總RNA急速抽提試劑盒并根據(jù)其說明書步驟提取病毒總RNA。將提取的病毒總RNA依據(jù)SMART MMLV Reverse Transcriptase說明書反轉(zhuǎn)為cDNA，放-20℃冰箱備用。

1.4 PCR鑒定及產(chǎn)物純化參照自HOFFMANN等[4]設(shè)計(jì)的通用引物(由上海生工合成)和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)聚合酶說明書配制50 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃30 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 2 min 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min，4℃保存。

配制1%瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切膠。根據(jù)普通瓊脂糖DNA回收試劑盒，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.5 PCR產(chǎn)物克隆在微量離心管中加入pMD19-T Vector 0.2 μL、純化后的DNA 2.3 μL和Solution Ⅰ 5 μL配制10 μL反應(yīng)體系，16℃連接過夜。

依據(jù)pMDTM19-T Vector Cloning Kit說明書將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并將其涂布到含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落，接種到LB液體培養(yǎng)液中進(jìn)行搖菌，并對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 序列測(cè)序及分析將含有目的片段的菌液送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用NCBI進(jìn)行對(duì)比分析，并用MAGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離經(jīng)血凝試驗(yàn)和PCR檢測(cè)，本試驗(yàn)從2017年采集自新疆艾比湖自然保護(hù)區(qū)野鳥的糞便棉拭子中分離得到1株H1N2亞型AIV，并命名為：A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)。

2.2 分離株全基因組序列測(cè)序結(jié)果將測(cè)序后的病毒全基因序列在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示各基因片段分別與H1、H2、H4、H7多種亞型的AIV高度同源(表1)。

表1 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)株BLAST比對(duì)分析結(jié)果

2.3 基因組進(jìn)化分析

2.3.1HA基因序列分析 分離株A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)HA基因全長(zhǎng)1 805 bp，編碼區(qū)30～1 731 bp，共1 701 bp，編碼566個(gè)氨基酸。在NCBI網(wǎng)站經(jīng)BLAST比對(duì)分析后該毒株HA基因與毒株A/mallard duck/Georgia/11/2011(H1N1)的HA基因同源性最高，其核酸的一致性為96.12%。在MAGA 7.0上繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1，分析得知其屬于歐亞譜系。

該毒株的裂解位點(diǎn)為NIPSIQSR↓GLFGAIAGF，不含有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，符合低致病性AIV氨基酸的序列特征。毒株A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別為27NNS29、28NST30、40NVT42、104NGT106、304NSS306、498NGT500和557NGS559，并未出現(xiàn)核苷酸突變。但其與同源性最高毒株A/mallard duck/Georgia/11/2011(H1N1)相比出現(xiàn)了10個(gè)氨基酸突變，其位點(diǎn)分別為13I-G、15S-L、137T-A、138S-N、154L-S、202A-T、203S-N、212A-T、218V-I和232V-A，其全部位于HA1。

圖1 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株HA基因遺傳進(jìn)化樹

2.3.2NA基因序列分析 毒株A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)NA基因全長(zhǎng)1 484 bp，編碼區(qū)為51～1 461 bp，共1 410 bp，共編碼469個(gè)氨基酸。在NCBI網(wǎng)站經(jīng)BLAST比對(duì)分析后該毒株NA基因與毒株A/garganey/Republic of Georgia/1/2011(H4N2)的NA基因同源性最高，其核酸的一致性為97.43%。在MAGA 7.0上繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2，分析得知其屬于歐亞譜系。該毒株NA基因有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別為61NIT63、69NNT71、86NWS88、146NGT148、200NAT202、234NGT236、403NWS405。其與NA基因同源性最高的毒株A/garganey/Republic of Georgia/1/2011(H4N2)相比，存在7個(gè)氨基酸變異，分別為18T-A、86N-D、125N-S、126S-P、141N-D、192A-V和212A-V，增加一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，即86NWS88。NA 分子中與流感病毒抗達(dá)菲類藥物相關(guān)的274( H-Y) 氨基酸位點(diǎn)沒有發(fā)現(xiàn)突變[5]，且294為N，預(yù)測(cè)對(duì)奧司他韋類藥物敏感[6]。

圖2 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株NA基因遺傳進(jìn)化樹

2.3.3病毒內(nèi)部基因序列分析及進(jìn)化 該毒株內(nèi)部基因序列分析及進(jìn)化顯示，NS基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-698C/2016(H7N3)有較高的同源性(圖3)，其核酸的一致性為99.33%；M基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-125OP/2015(H7N3)有較高的同源性(圖4)，其核酸的一致性為98.73%；NP基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-487OP/2016(H7N3)有較高的同源性(圖5)，其核酸的一致性為98.85%；PA基因與毒株A/mallard duck/Georgia/10/2016(H7N7)有較高的同源性(圖6)，其核酸的一致性為98.61%；PB1基因與毒株A/northern shoveler/Egypt/MB-D-695C/2016(H7N3)有較高的同源性(圖7)，其核酸的一致性為98.55%；PB2基因與毒株A/duck/Mongolia/655/2015(H2N3)有較高的同源性(圖8)，其核酸的一致性為97.15%。無疑，該毒株與其他亞型病毒發(fā)生了重組。

內(nèi)部基因序列分析顯示，NS蛋白中92D突變?yōu)镋可導(dǎo)致病毒對(duì)干擾素產(chǎn)生抗性[5]，而在分離株中并未檢測(cè)到該突變。除此之外，42S、149A均未出現(xiàn)與感染哺乳動(dòng)物或致病性增強(qiáng)的突變[7]。但是本分離株NS基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-698C/2016(H7N3)相比139D突變?yōu)?39G，該突變是否會(huì)對(duì)毒株的致病力產(chǎn)生影響尚未可知。M2離子通道蛋白未發(fā)生突變31S-N，顯示對(duì)金剛烷胺和金剛乙氨敏感[8]。但是本分離株與毒株A/teal/Egypt/MB-D-125OP/2015(H7N3)相比，M2蛋白發(fā)生突變77L-R。NP基因與毒株A/teal/Egypt/MB-D-487OP/2016(H7N3)相比出現(xiàn)4個(gè)氨基酸變異，分別為105L-V、119V-I、193I-L、364R-Q。PA基因97T-I、515T-A，PB1基因198K-I、317M-K、436Y-H，均未發(fā)生使該分離株毒力增強(qiáng)的突變[9]。PB2基因中與宿主特異性和病毒復(fù)制能力有關(guān)的627E和701D并未發(fā)生突變[10-11]，但PB2蛋白與毒株A/duck/Mongolia/655/2015(H2N3)相比出現(xiàn)2個(gè)氨基酸變異，分別為639D-N、464M-L。

圖3 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株NS基因遺傳進(jìn)化樹

圖4 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株M基因遺傳進(jìn)化樹

圖5 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株NP基因遺傳進(jìn)化樹

圖6 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株P(guān)A基因遺傳進(jìn)化樹

圖7 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株P(guān)B1基因遺傳進(jìn)化樹

圖8 A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017(H1N2)AIV分離株P(guān)B2基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

AIV基因組由8個(gè)節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA構(gòu)成，編碼8種病毒蛋白[12-18]。HA是一種表面糖蛋白，它對(duì)流感病毒的毒力、免疫原性和種間傳播有著重要的意義。HA蛋白合成后信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除形成HA0，在宿主蛋白酶作用下裂解而激活為HA1和HA2，分別主要介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜的接觸吸附和促使病毒與細(xì)胞膜融合來完成病毒入侵細(xì)胞的過程[19]。低致病性AI的HA裂解位點(diǎn)由呼吸道和消化道的胰蛋白酶樣蛋白酶識(shí)別，而高致病性AI攜帶多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，使其被無處不在的糖蛋白樣蛋白酶切割，導(dǎo)致全身性感染和高死亡率[20]。而NA酶活性的強(qiáng)弱會(huì)影響唾液酸受體的切割，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制使病毒表現(xiàn)出宿主特異性；NA基因的突變、插入或缺失都會(huì)導(dǎo)致酶活性的改變，使病毒突破種間障礙來引起流感的大暴發(fā)[21]。本實(shí)驗(yàn)室分離的毒株HA裂解位點(diǎn)為NIPSIQSR↓GLFGAIAGF，不含有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸；NA頸部沒有氨基酸缺失，符合低致病性AI的特征。除此之外，本分離株NS蛋白中92D，M2離子通道蛋白31S，PA基因中97T、515T，PB1基因中198K、317M、436Y，PB2基因中627E和701D均未發(fā)生突變。

艾比湖位于新疆博州地區(qū)精河縣城以北35 km處，面積大約600 km2，是新疆第一大咸水湖[22]，更是候鳥的一個(gè)重要棲息地。秋季候鳥在新疆大致有3條遷徙路線，分別是東南亞路線、印巴路線和北非路線，而艾比湖位于這3條路線的樞紐位置，是中亞鳥類遷徙的主要驛站[22]。野生水禽帶毒的現(xiàn)象十分普遍，更被認(rèn)為是AIV的自然儲(chǔ)庫(kù)。調(diào)查表明艾比湖鳥類資源不僅數(shù)量眾多，而且種類豐富，幾乎占全疆的55%[23]。在野鳥遷徙過程中，病毒可以在不同野鳥體內(nèi)進(jìn)行不斷地進(jìn)化和重配。而野鳥和家禽之間也可能存在病毒傳播[23]，當(dāng)AIV由野鳥傳播到家禽的時(shí)候，病毒的變異或進(jìn)化速度往往會(huì)明顯加快，其結(jié)果往往是導(dǎo)致家禽致死病的發(fā)生，甚至是帶來災(zāi)難性的后果[24]。因此，檢測(cè)艾比湖及周邊地區(qū)野鳥的AIV帶毒情況，對(duì)預(yù)防AI的發(fā)生具有十分重要的意義。

本研究從新疆艾比湖自然保護(hù)區(qū)野鳥采集的糞便棉拭子中分離出了1株H1N2亞型的低致病性AIV。經(jīng)對(duì)分離株的基因分析得知，其存在與多種亞型AIV的重配現(xiàn)象。而其PB2基因更是與鴨源AIV的PB2基因同源性最高，有感染家禽的潛力，值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。