劉 洋，王新杰，汪葆玥，李 翔，高姍姍，馬 靜，孫曉明，王傳彬，倪建強*

(1.中國動物疫病預防控制中心，北京 102618；2.北京億森寶生物科技有限公司，北京 100025；3.中國牧工商集團有限公司，北京 100070)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度致死性傳染病。該病病程短，死亡率高，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定通報的動物疫病[1]，我國也將其列為一類動物疫病[2]。2018年8月，我國首次發(fā)生ASF疫情。之后該病迅速蔓延擴散，截止2019年12月，除澳門、臺灣外，我國大陸所有32個省級行政區(qū)均已發(fā)生ASF疫情，全國范圍內(nèi)累計撲殺生豬超過100萬頭，直接和間接損失巨大。同時，ASF在亞洲也持續(xù)蔓延擴散，在蒙古、越南、柬埔寨、朝鮮、老撾、緬甸、菲律賓、韓國和東帝汶等多個國家相繼暴發(fā)疫情，ASF防控面臨嚴峻的國際形勢。

目前，世界范圍內(nèi)尚未研制成功安全有效的ASF疫苗，其防控主要依賴于及時、準確的病原檢測和消滅傳染源[3-10]。為此，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求，在ASF防控期間，除養(yǎng)殖場外，全國生豬屠宰及生豬產(chǎn)品流通等環(huán)節(jié)要全面開展檢測。我國《非洲豬瘟防治技術規(guī)范(試行)》中推薦了3種ASFV病原檢測方法，包括雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗、聚合酶鏈式反應(PCR)和實時熒光聚合酶鏈式反應(熒光PCR)[3]，其中熒光PCR技術因其敏感性高、特異性強且自動化程度高，被OIE、FAO和我國相繼推薦用于ASF的檢測[1]。但常規(guī)熒光PCR普遍存在核酸提取過程復雜，檢測用時較長等缺陷，導致檢測效率低下，不能滿足于現(xiàn)場快速檢測的需求。為此，本研究結(jié)合樣本處理液進行全血樣本及組織樣本的快速前處理，建立了免提取微芯片熒光PCR，檢測用時僅為30 min，且簡化了檢測步驟，使熒光PCR成為適合于屠宰場、養(yǎng)殖場和流通環(huán)節(jié)ASF檢測的技術，為疫情處置爭取了時間。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器GoTaq hot start polymerase、High Pure dNTPs、MgCl2和10×Buffer均購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；DNase/RNase-Free去離子水、質(zhì)粒小提試劑盒和磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；礦物油購自索萊寶生物技術有限公司；30孔微芯片購自加拿大魯美科思儀器設備有限公司。TISSUELYSER Ⅱ組織研磨儀由Qiagen 生產(chǎn)；SCIENTIFIC KINGFISHER自動化核酸提取儀由THERMO生產(chǎn)；ABI 7500 fast熒光PCR儀由Life公司生產(chǎn)；微量芯片熒光PCR儀由北京億森寶科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 樣品豬瘟病毒(CFSV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬細小病毒(PPV)來源于市售弱毒活疫苗；豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬偽狂犬病病毒(PRV)由中國動物疫病預防控制中心獸醫(yī)診斷室分離保存。臨床樣品來自不同省份送檢的疑似臨床病料，包括66份豬全血和51份豬組織樣品，共計117份。

1.3 樣品處理液配制按照如下比例配制樣品處理液：Tris-HCl終濃度100 mmol/L，NaCl終濃度1.4 mol/L，MgCl2終濃度1.5 mmol/L，NP-40終濃度1%。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建參照GenBank中ASFV Georgia 2007毒株B646L基因序列，合成全基因片段，由華大基因合成并克隆于pUC-57載體，獲得重組質(zhì)粒(命名為pUC-57-B646L)及其轉(zhuǎn)化菌，質(zhì)粒經(jīng)提取后溶于TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH 8.0)，測定D260和D280值，計算質(zhì)量濃度。

1.5 引物及探針的設計參照GenBank中ASFV的24個亞型，經(jīng)DNAMAN6.0軟件對其B646L基因部分序列進行比對，在其保守區(qū)域設計引物與TaqMan探針(ASFV-F、ASFV-R及ASFV-Probe)，序列見表1，均由華大基因合成。

1.6 臨床樣品的處理將臨床采集的樣品處理液作為微芯片熒光待檢物，具體處理方法為組織樣品勻漿后取100 μL加入150 μL樣品處理液，離心1 min，取上清備用；全血樣品取20 μL加入780 μL樣品處理液，混合均勻，取混合液備用。同時，采用磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒提取臨床采集樣品的核酸，用于OIE推薦熒光PCR方法的檢測。

1.7 微芯片熒光PCR反應體系的優(yōu)化采用方陣法對反應體系的引物和探針終濃度(0.1,0.2,0.3,0.4 μmol/L)、Mg2+終濃度(0.5,1.0,1.5,2.0 mmol/L)、GoTaq hot start polymerase終濃度(0.1,0.2，0.3，0.4,0.5 U/μL)等進行優(yōu)化。根據(jù)方陣法篩選出來的最優(yōu)引物、探針、Mg2+和Gotaq hot start polymerase終濃度配制反應液，模板核酸DNA體積和體系總體積分別按比例1∶2.5,1∶2.0,1∶1.5,1∶1,1∶0.5加入，其余用無核酸酶水分別補足至1.2 μL。根據(jù)檢測結(jié)果選擇最優(yōu)微芯片規(guī)格以及模板核酸DNA體積。

表1 引物及探針序列

1.8 微芯片熒光PCR反應條件的優(yōu)化反應條件第一步，預變性為95℃，時間分別為1,3,5,10 min；第二步循環(huán)次數(shù)分別為35,40,45個循環(huán)，變性溫度為95℃，時間分別為3,5,10,15 s；隨后進行退火及延伸溫度為55℃和60℃，時間分別為15,30,45,60 s，并在此步驟收集熒光信號。

1.9 OIE推薦熒光PCR反應體系及反應條件參照《OIE陸生動物診斷與疫苗手冊》中ASF熒光PCR檢測方法進行擴增，引物及探針序列見表1，反應體系見表2。在ABI 7500 fast熒光PCR儀上進行以下反應，反應程序：預變性，95℃ 10 min，1個循環(huán)；熒光PCR擴增 95℃ 15 s，58℃ 1 min，40個循環(huán)。在58℃ 延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE。試驗結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結(jié)果。

表2 OIE熒光PCR檢測試劑反應體系

1.10 微芯片熒光PCR反應特異性分別提取CFSV、PRRSV、PCV1、PCV2、PRV和PPV基因組核酸，用已建立的ASFV微芯片熒光PCR方法分別對其進行檢測，以無核酸酶滅菌水作為陰性對照，以含有重組質(zhì)粒pUC-57-B646L的TE溶液為陽性對照，分析評估該方法的特異性。

1.11 微芯片熒光PCR反應靈敏性將含有質(zhì)粒pUC-57-B646L的TE原液(濃度為1012拷貝/μL)，用無核酸酶水稀釋成10-6,10-7,10-8,10-9,10-10,10-11,10-12共7個稀釋度，使用ASF微芯片熒光PCR最優(yōu)體系及反應條件進行檢測，同時用同樣稀釋的相同模板進行OIE推薦的熒光PCR方法平行檢測，以確定和比較兩種檢測方法的靈敏性。

1.12 微芯片熒光PCR反應重復性利用本研究所建立的方法初步組裝成試劑盒，選用同一批次的3個試劑盒對8份ASFV陽性樣品和8份陰性樣品進行檢測，評價其批內(nèi)重復性；選用3個不同批次的試劑盒對同樣8份陽性和8份陰性樣品進行檢測，評價其批間重復性。

1.13 臨床樣品的檢測將采自不同地區(qū)的全血和組織樣品按照1.6方法處理，利用本研究所建立的微芯片熒光PCR進行檢測。同時，提取樣品總DNA 為模板，利用OIE推薦的熒光PCR方法進行檢測，并對結(jié)果進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 ASFV微芯片熒光PCR的建立經(jīng)過對微芯片熒光PCR方法進行優(yōu)化，最終確定反應體系為1.2 μL，引物、探針終濃度為0.2 μmol/L，Mg2+終濃度為1.5 mmol/L，Gotaq hot start polymerase終濃度為0.3 U/μL；模板核酸DNA體積和體系總比例為1∶1，每個反應加入量0.6 μL。反應最佳條件：95℃ 3 min，1個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 30 s，在此步驟收集熒光信號，共40個循環(huán)。

2.2 微芯片熒光PCR特異性特異性試驗結(jié)果顯示，ASF微芯片熒光PCR方法除陽性對照出現(xiàn)特異性擴增曲線以外，對CFSV、PRRSV、PCV1、PCV2、PRV和PPV等的基因組核酸均呈陰性，說明該方法特異性良好。

2.3 微芯片熒光PCR靈敏性靈敏性試驗結(jié)果表明(表3)，ASF微芯片熒光PCR方法的最低檢測濃度為10拷貝/μL，Ct值為37.12，而OIE推薦的熒光PCR方法的最低檢測限為102拷貝/μL。上述結(jié)果表明微芯片熒光PCR方法的靈敏度優(yōu)于OIE推薦的熒光PCR方法。

2.4 微芯片熒光PCR重復性利用所建立的方法進行批內(nèi)和批間重復性檢測，結(jié)果顯示，陰性樣品檢測均為陰性，陽性樣品的批內(nèi)(0.14%～0.54%)及批間(0.04%～1.37%)變異系數(shù)均<2%(表4)，表明該試劑盒具有較好的重復性。

2.5 微芯片熒光PCR方法的應用將117份臨床樣品經(jīng)快速提取，所得的核酸粗提物利用所建的微芯片熒光PCR方法進行檢測，結(jié)果顯示，共檢出陽性樣品40份，陰性樣品77份。上述結(jié)果與采用商品化核酸提取試劑盒經(jīng)OIE推薦的ASFV熒光PCR方法檢測結(jié)果完全一致，結(jié)果見表5，兩種方法的總符合率為100%。

表3 ASFV微芯片熒光PCR靈敏度檢測結(jié)果

表4 陽性樣品批內(nèi)及批間重復性檢測結(jié)果

表5 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

自2018年我國首次發(fā)生ASF，一年半的時間里該病傳播到我國除澳門、臺灣外所有省級行政區(qū)劃，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了深遠的影響[8-10]。據(jù)國家統(tǒng)計局2019年11月9日公布的數(shù)據(jù)顯示，2019年10月，豬肉價格上漲101.3%，影響當月全國居民消費價格(CPI)上漲達到64%[4]。為此，國務院辦公廳出臺《關于加強非洲豬瘟防控工作的意見》(國辦發(fā)[2019]31號)文件，“鼓勵養(yǎng)豬場(戶)自行開展非洲豬瘟檢測，及早發(fā)現(xiàn)和處置隱患”，“督促指導生豬屠宰廠(場)落實各項防控措施，配齊非洲豬瘟檢測儀器設備，按照批批檢、全覆蓋原則，全面開展非洲豬瘟檢測，切實做好疫情排查和報告”。鑒于屠宰場開展檢測所面臨的不同于常規(guī)實驗室檢測的特殊工作環(huán)境，檢測的快速、準確就顯得尤為重要[11]。

為滿足我國ASF病原檢測的需求，研究人員相繼建立了多種核酸檢測技術，如楊吉飛等[12]、王彩霞等[13]建立了ASFV環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)快速檢測技術，可以將反應時間控制在30～60 min，靈敏度為10拷貝質(zhì)粒DNA[7]或2 fg重組質(zhì)粒[12]。林彥星等[14]建立了熒光RPA快速檢測方法，可以將反應控制在15 min完成，靈敏度為20 copies/μL。GAO等[15]建立了一種交叉引物擴增-試紙條方法，用于快速現(xiàn)地檢測ASFV，最低檢測限為200拷貝，與熒光定量PCR的符合率為97.8%。這些方法是ASFV檢測的重要探索，且在診斷中發(fā)揮了重要作用。但是，在檢測技術的接受程度、產(chǎn)品應用范圍等方面，熒光PCR技術仍是ASFV最主要的確診技術。

本研究設計合成了ASFVB646L基因特異性引物和TaqMan探針，建立了基于微芯片這一反應載體的熒光PCR技術，同時結(jié)合樣品處理液快速提取核酸，在保證檢測結(jié)果準確的基礎上，大大縮短了檢測所需時間。應用本研究所建立的方法，對CFSV、PRRSV、PCV1、PCV2、PRV和PPV等6種常見豬病病毒進行檢測，結(jié)果顯示均為陰性，無任何特異性擴增曲線，說明該方法特異性良好。且該方法最低可檢測到1×101拷貝/μL的ASFV，比OIE推薦的熒光PCR反應靈敏10倍。批內(nèi)、批間重復性檢測的變異系數(shù)低于2%，說明該方法重復性良好。通過對包括40份ASF陽性臨床樣品在內(nèi)的117份豬臨床樣品(包括全血和組織)經(jīng)快速提取后進行微芯片熒光PCR檢測，結(jié)果與商品化試劑盒提取核酸后經(jīng)OIE推薦的熒光PCR方法結(jié)果完全一致，說明本方法完全適用于ASFV的臨床檢測。另外，本研究中建立的熒光PCR方法，與常規(guī)方法相比，反應體積僅1.2 μL，在節(jié)省反應成本的同時縮短升降溫所需時間，僅需30 min即可完成反應。而且反應室的芯片不同于普通塑料反應管，溫控更好，體系內(nèi)溫度更為均勻，有利于反應的充分進行。

ASFV微芯片熒光PCR建立之后，組裝了試劑盒，參與并獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第一批ASF現(xiàn)場快速檢測試劑的推薦。臨床應用證實，微芯片熒光PCR方法特異、敏感、簡便、經(jīng)濟、快速，對于屠宰場或其他需要對ASF開展快速檢測的工作場所具有重要的意義。