黃超華，花群義，曹琛福，史衛(wèi)軍，阮周曦，林彥星,葉奕優(yōu)，陶 虹，王 瀟，陳金頂*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

藍(lán)舌病(bluetongue，BT)是一種蟲媒性傳染病，屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties，OIE)規(guī)定及時(shí)上報(bào)的動(dòng)物疫病。BT的流行和暴發(fā)會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前疫苗免疫是預(yù)防BT的主要有效手段[1-2]。藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus,BTV)病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)疫苗由于具有DIVA (disabled infectious single animal)性質(zhì)基因工程苗的特點(diǎn)，因而成為BT疫苗研究的熱點(diǎn)之一[3-4]。該VLPs由BTV的4種結(jié)構(gòu)蛋白 VP2、VP3、VP5和VP7組裝而成，其中60個(gè)VP3二聚體組裝形成直徑為55 nm的BTV病毒亞核心，其外層為VP7三聚體構(gòu)成的二十面體結(jié)構(gòu)，兩者共同構(gòu)成BTV CLPs[5]。VP2是BTV型特異性抗原，是BTV血清型的主要決定因素，能引起血凝，誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[6]。而VP5是BTV唯一的糖基化蛋白,在VP2免疫中和反應(yīng)中起到了重要的增強(qiáng)作用[7]。VP5與VP2一樣以三聚體形式存在，VP5三聚體最終形成球形基序與VP2三聚體形成的三腳蛋白復(fù)合體共同構(gòu)成BTV VLPs的外衣層結(jié)構(gòu)[3,8-10]。

流行病學(xué)調(diào)查和有關(guān)的病毒分離報(bào)道顯示，我國(guó)存在的BTV血清型非常多，其中1和16型為主要血清型。目前我國(guó)雖然在BT疫苗研究上取得了諸多進(jìn)展，如滅活疫苗、DNA疫苗、重組痘病毒載體疫苗和重組腺病毒疫苗等均能產(chǎn)生中和抗體，對(duì)動(dòng)物有一定的免疫保護(hù)作用[11-12]，但在BTV VLPs疫苗方面研究較少。本試驗(yàn)通過基因工程技術(shù)獲取具有4個(gè)獨(dú)立啟動(dòng)子的載體，構(gòu)建具有BTV-16型4種結(jié)構(gòu)蛋白基因VP2、VP3、VP5和VP7的重組桿狀病毒并進(jìn)行真核表達(dá)，以期為BTV VLPs疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料pFastBac-Dual質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞DH5α和DH10Bac購(gòu)自Invitrogen公司；BTV-16型綿羊陽(yáng)性血清和昆蟲細(xì)胞Sf9由本實(shí)驗(yàn)室保存；Cellfectin?Ⅱ Reagent、SF-900Ⅲ培養(yǎng)基、PureLinkTMHiPure質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶以及Taq酶、BacPAKTMBaculovirus Rapid Titer Kit購(gòu)自TaKaRa公司；Rabbit Anti-SheepIgG H&L(HRP)購(gòu)自Abcam公司；TMB顯色試劑盒購(gòu)自上海生工公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成分別根據(jù)BTV-16 S2、L3、S6和S7基因參考序列設(shè)計(jì)并合成各自的特異性引物用于構(gòu)建重組質(zhì)粒的篩選和鑒定；根據(jù)F4序列設(shè)計(jì)并合成F4序列特異性引物用于載體的改造；參照Bac-to-Bac昆蟲桿狀表達(dá)系統(tǒng)操作說明，合成1對(duì)公用引物M13-F和M13-R，用于重組桿粒的篩選和鑒定。具體引物序列見表1。

1.3 pFastBac-Dual載體的改造為共表達(dá)BTV結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP5、VP3和VP7，對(duì)載體pFastBac-Dual進(jìn)行改造，使其具有4個(gè)多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site,MSC)，并且每個(gè)多克隆位點(diǎn)均具有各自獨(dú)立的啟動(dòng)子。分析載體pFastBac-Dual的全序列，發(fā)現(xiàn)在載體的3 510堿基處為Bsp1407Ⅰ酶切位點(diǎn)且是唯一的，3 985堿基處為SnaBⅠ酶切位點(diǎn)且是唯一的，同時(shí)在3 510～3 985堿基處沒有任何元件，因此可作為改造區(qū)域?qū)d體進(jìn)行改造。

表1 所用引物序列

由于原載體已有2個(gè)多克隆位點(diǎn)，各自的啟動(dòng)子分別為Polyhedrin和P10，因此本研究通過Bsp1407Ⅰ和SnaBⅠ雙酶切載體pFastBac-Dual，切除3 510～3 985堿基處的序列，隨后插入一段合成的序列F4(該序列含3 510～3 985堿基的序列和2個(gè)多克隆位點(diǎn)，且該2個(gè)多克隆位點(diǎn)具有各自獨(dú)立的啟動(dòng)子)，該序列共1 347 bp，其組成如圖1所示，從而完成載體的改造。改造后的載體命名為pF4，整個(gè)載體圖譜見圖2，其中MSC1和MSC2為2個(gè)新插入的多克隆位點(diǎn)，其啟動(dòng)子分別為P10和Polyhedrin，而MSC3和MSC4為原有的2個(gè)多克隆位點(diǎn)，其啟動(dòng)子分別為P10和Polyhedrin。

圖1 合成序列F4組成

圖2 pF4圖譜

1.4 pF4-VP2-VP5-VP3-VP7的構(gòu)建通過NCBI 基因庫(kù)比對(duì)找到與BTV-16的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP5、VP3和VP7同源性較高的基因序列(AB686226.1、KF664138.1、KP339226.1和JX007-928.1)，并以此為參考序列，通過上海生工公司合成VP2、VP5、VP3和VP7基因序列從而獲得重組質(zhì)粒pUC-VP2(VP2序列的5′和3′端分別有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和SalⅠ)、pUC-VP5(VP5序列的5′和3′端分別有酶切位點(diǎn)XhoⅠ和SphⅠ)、pUC-VP3(VP3序列的5′和3′端分別有酶切位點(diǎn)NcoⅠ和 NheⅠ)和pUC-VP7(VP7序列的5′和3′端分別有酶切位點(diǎn)AatIⅠ和Eco81Ⅰ)。按照常規(guī)的分子克隆技術(shù)，即雙酶切、T4連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、菌落PCR和雙酶切鑒定等方法，依次將VP2、VP5、VP3和VP7基因插入到改造后的載體pF4的4個(gè)多克隆位點(diǎn)，其中VP2插入到MSC4，VP5插入到MSC3，VP3插入到MSC1，VP7插入到MSC2，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7，質(zhì)粒圖譜見圖3。

1.5 重組桿粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7的提取通過熱轉(zhuǎn)化的方式將重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，平鋪于含卡那霉素、四環(huán)素、IPTG和Bluo-gal的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h；挑取單個(gè)白色菌落劃線于新的上述平板并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。挑取單個(gè)白色菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，確定VP2-VP5-VP3-VP7是否轉(zhuǎn)座成功。鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的，過夜大量培養(yǎng)，并用PureLinkTMHiPure質(zhì)粒純化試劑盒大量提取純化重組桿粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7。

圖3 pF4-VP2-VP5-VP3-VP7圖譜

1.6 構(gòu)建重組桿狀病毒rBac-VP2-VP5-VP3-VP7用轉(zhuǎn)染試劑盒Cellfectin?Ⅱ Reagent將重組桿粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照，持續(xù)觀察細(xì)胞病變情況。在細(xì)胞病變明顯時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即P1代重組桿狀病毒rBac-VP2-VP5-VP3-VP7，并繼續(xù)傳代以提高重組桿狀病毒的滴度。使用TaKaRa公司的BacPAKTMBaculovirus Rapid Titer Kit測(cè)定重組桿狀病毒的滴度。

1.7 BTV VLPs的純化將無血清培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶至75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(60%～80%)，貼壁1 h 后，接入適量的重組桿狀病毒，72 h時(shí)棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL細(xì)胞裂解液冰上裂解15 min，并反復(fù)凍融3次使細(xì)胞充分裂解，12 000 r/min，4 ℃離心10 min收集細(xì)胞裂解上清。按照前述方法大量接毒、裂解細(xì)胞、離心收集細(xì)胞裂解上清，并用Millipore超濾管進(jìn)行離心濃縮。采用蔗糖梯度離心純化濃縮后的細(xì)胞裂解上清中的BTV VLPs，蔗糖梯度離心條件參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]。

1.8 4種結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性鑒定取少量純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAEG和Western blot分析，其中Western blot 分析時(shí)，以Protein-Free T20 (PBS) Blocking Buffer室溫封閉1 h；洗滌后加入綿羊BTV-16陽(yáng)性血清(1∶500稀釋)，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入Rabbit Anti-Sheep IgG H&L(HRP)(1∶5 000稀釋)，37℃孵育45 min，洗滌后顯色。

1.9 BTV VLPs電鏡觀察取少量蔗糖梯度離心純化的樣品，采用醋酸鈾負(fù)染法對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染并固定在載網(wǎng)上，在TEM電鏡下觀察VLPs形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 pFastBac-Dual載體的改造由上海生工公司合成F4序列，獲得重組質(zhì)粒pUC-F4。用Bsp1407 Ⅰ和SnaBⅠ雙酶切載體pFastBac-Dual和重組質(zhì)粒pUC-F4，獲得具有黏性末端的pFastBac-Dual和F4片段。通過連接、轉(zhuǎn)化、鑒定(菌落PCR、雙酶切和測(cè)序)，構(gòu)建了改造后的載體pF4。用F4序列特異性引物進(jìn)行菌落PCR可得到1 347 bp左右的目的條帶，以Bsp-1407Ⅰ和SnaBⅠ雙酶切提取的質(zhì)?？傻玫? 853 bp 大小的原載體條帶和1 347 bp大小的目的條帶，結(jié)果見圖4。并對(duì)改造后的載體pF4進(jìn)行全基因測(cè)序，確認(rèn)載體pF4包含4個(gè)克隆位點(diǎn)和4個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子，且全序列未發(fā)生突變，所有元件完整。

M.DL5000 DNA Marker；1.Bsp1407Ⅰ和SnaBⅠ雙酶切； 2.菌落PCR

2.2 重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7的構(gòu)建按照常規(guī)的分子克隆技術(shù)，依次將VP2、VP5、VP3和VP7插入到載體pF4中，從而構(gòu)建了重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7。構(gòu)建鑒定結(jié)果見圖5。

A.重組質(zhì)粒pF4-VP2的鑒定結(jié)果(M.DL5000 DNA Marker；1.雙酶切；2.菌落PCR)；B.重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5的鑒定結(jié)果(M.DL15000 DNA Marker；1.菌落PCR；2.雙酶切)；C.重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5-VP3的鑒定結(jié)果(M.DL15000 DNA Marker；1.菌落PCR；2.雙酶切)；D.重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7的鑒定結(jié)果(M.DL15000 DNA Marker；1.菌落PCR；2.雙酶切)

2.3 重組桿粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7的提取將重組質(zhì)粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7轉(zhuǎn)化入DH10Bac發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過藍(lán)白斑和菌落PCR篩選出轉(zhuǎn)座成功的菌落，并用質(zhì)粒純化試劑盒大量提取純化重組桿粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7。分別以VP2特異性上下游引物、VP3特異性上下游引物、VP5特異性上下游引物和VP7特異性上下游引物進(jìn)菌落PCR，可以獲得2 900,2 700,1 500,1 000 bp的目的條帶分別對(duì)應(yīng)VP2、VP3、VP5和VP7；為進(jìn)一步確認(rèn)是否轉(zhuǎn)座成功，分別以VP2-F+M13-R、M13F+VP2-R引物組合進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示分別可以獲得3 600,12 000 bp的目的條帶，與預(yù)期的結(jié)果相符，結(jié)果見圖6。

2.4 重組桿狀病毒rBac-VP2-VP5-VP3-VP7的獲得用轉(zhuǎn)染試劑盒將重組桿粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48～72 h可以觀察到明顯的細(xì)胞病變：與正常Sf9細(xì)胞相比，細(xì)胞數(shù)量變少，體積變大且發(fā)生臌脹、變得容易脫落，并有少量細(xì)胞破碎，見圖7。轉(zhuǎn)染后超過72 h，Sf9細(xì)胞大量破碎。

2.5 BTV VLPs的純化及SDS-PAGE和Western blot 分析通過蔗糖梯度離心純化得到BTV VLPs，取少量純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE(圖8)和Western blot(圖9)分析，結(jié)果均出現(xiàn)4條分別為110,100,60,38 kDa左右的主要條帶，所對(duì)應(yīng)的蛋白分別為VP2、VP3、VP5和VP7，說明本研究構(gòu)建的重組桿狀病毒可以在Sf9細(xì)胞中共表達(dá)BTV-16的4種結(jié)構(gòu)蛋白并且具有免疫原性。

2.6 電鏡觀察結(jié)果取少量純化產(chǎn)物通過醋酸鈾負(fù)染固定于載網(wǎng)上，在透射電鏡下觀察其形態(tài)。結(jié)果顯示，純化的樣品中存在數(shù)量較多的中空顆粒，大小形態(tài)略有不同，其中也有部分中空顆粒直徑為75～85 nm，顆粒側(cè)壁較厚，且表面的突起不明顯，其形態(tài)、大小與文獻(xiàn)報(bào)道的BTV VLPs一致。圖10為透射電鏡下不同視野觀察到的具有典型形態(tài)的BTV-16的VLPs，并有少量中空顆粒直徑為60～70 nm，顆粒表面有非常明顯的突起，其形態(tài)、大小均與文獻(xiàn)報(bào)道的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的BTV CLPs一致。

M1.DL5000 DNA Marker；1.引物組合(VP2-F+VP2-R)菌落PCR結(jié)果；2.引物組合(VP3-F+VP3-R)菌落PCR結(jié)果；3.引物組合(VP5-F+VP5-R)菌落PCR結(jié)果；4.引物組合(VP7-F+VP7-R)菌落PCR結(jié)果；5.引物組合(VP2-F+M13-R)菌落PCR結(jié)果；6.引物組合(M13-F+VP2-R)菌落PCR結(jié)果；M2.DL15000 DNA Marker

A.正常Sf9細(xì)胞；B.重組桿粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞

3 討論

VLPs的制備均是通過構(gòu)建的表達(dá)載體在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中共表達(dá)多個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，使結(jié)構(gòu)蛋白在體外實(shí)現(xiàn)自組裝、形成具有原病毒類似形態(tài)結(jié)構(gòu)的中空顆粒。目前，用于制備VLPs的表達(dá)體系包括昆蟲桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系(Bac-to-Bac)、植物細(xì)胞表達(dá)體系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系以及原核表達(dá)體系。其中昆蟲桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系最為常用，只有少數(shù)病毒VLPs在原核表達(dá)體系中構(gòu)建成功。FRENCH等[14]和王健偉等[15]分別通過昆蟲桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系(Bac-to-Bac)成功制備了BTV-10、BTV-17和BTV-13 的VLPs，而THUENEMANN等[13,16]在植物細(xì)胞中共表達(dá)BTV-8 VP2、VP5、VP3和VP7這4種結(jié)構(gòu)蛋白，成功制備出BTV-8 VLPs[13,16]。他們共同的特點(diǎn)均是通過構(gòu)建雙表達(dá)重組病毒(VP2+VP5組合和VP3+VP7組合)，然后讓這種病毒共感染真核細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)4種蛋白在同一個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)從而自組裝形成VLPs。由于共感染幾率相對(duì)較低，無法確保構(gòu)成VLPs的4種蛋白能在同一個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)，從而影響B(tài)TV VLPs形成的效率。為此。本研究對(duì)載體pFastBac-dual進(jìn)行改造，使其具有4個(gè)多克隆位點(diǎn)(MSC)。雖然存在降低單個(gè)蛋白表達(dá)水平的可能，但通過這一方式能夠確保4種蛋白在同一細(xì)胞中共表達(dá)，從而有利于4種蛋白實(shí)現(xiàn)自組裝形成VLPs。

M.蛋白Marker;1.Sf9細(xì)胞蛋白；2.純化的BTV VLPs

M.蛋白Marker;1.純化的BTV VLPs；2.正常Sf9細(xì)胞對(duì)照

圖10 電鏡不同視野下觀察到的VLPs(40 000×)

通過透射電鏡觀察BTV VLPs的大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)存在多種中空顆粒形態(tài)共存的現(xiàn)象，有無突起、直徑在50 nm左右的中空顆粒(SCLPs)，表面有非常明顯的突起；直徑為60～70 nm的中空顆粒(CLPs)，外側(cè)壁明顯增厚(25 nm左右)，表面突起不明顯；還有直徑為75～85 nm的中空顆粒(VLPs)，以及少量形態(tài)和直徑介于CLPs和VLPs之間的中空顆粒。這一結(jié)果與王健偉等[15]在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備VLPs和THUENEMANN等[13,16]在植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備VLPs的結(jié)果相一致。這一現(xiàn)象揭示了BTV VLPs的結(jié)構(gòu)和組裝過程，即首先VP3自組裝成亞核心顆粒(直徑最小、側(cè)壁最薄)，VP7在其外層形成突起結(jié)構(gòu)(CLPs的表面突起)，VP2和VP5共同構(gòu)成CLPs的外層結(jié)構(gòu)(側(cè)壁增厚、直徑最大，同時(shí)VP2和VP5蛋白在最外層從而遮掩住了VP7形成的突起結(jié)構(gòu))。而THUENEMANN等[13,16]利用CPMV-HT 和相應(yīng)的pEAQ載體系統(tǒng)(non-replicating system)在植物細(xì)胞中制備BTV VLPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低VP3表達(dá)水平可提高植物細(xì)胞中VLPs組裝效率。由于本研究所用的Bac-to-Bac系統(tǒng)屬于可復(fù)制體系，無法控制VP3的表達(dá)水平，因此并未對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究成功地構(gòu)建了可共表達(dá)BTV-16的4種結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP5、VP3和VP7的昆蟲桿狀病毒，并制備出結(jié)構(gòu)完整的BTV-16 VLPs，為下一步BTV-16 VLPs免疫效果評(píng)價(jià)以及相關(guān)疫苗的研制打下基礎(chǔ)。