鄭龍龍，朱玲云，劉萍丹，趙德育，劉 佳,畢峻龍，楊貴樹(shù)，舒相華*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 楚雄 675000)

香豬是我國(guó)優(yōu)良微型地方豬種，具有體型矮小、肉質(zhì)香嫩、皮薄骨細(xì)、玲瓏美觀和精靈逗人等特點(diǎn)，是加工制作色、香、味具全的高檔肉產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料，一般飼養(yǎng)5～7周齡的乳豬出欄、屠宰最為合適。云南省普遍飼養(yǎng)巴馬香豬，該品種源產(chǎn)于廣西巴馬瑤族自治縣，是一個(gè)具有悠久的飼養(yǎng)歷史和穩(wěn)定的遺傳基因且品質(zhì)優(yōu)良而珍貴稀有的地方小型豬品種。由于香豬飼養(yǎng)時(shí)間短，常不進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的免疫，因此容易感染該病。通過(guò)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)毒株的全基因組序列進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，推斷HP-PRRSV毒株是由我國(guó) CH-1a 樣PRRSV毒株演化而來(lái)的。同時(shí)2006 年豬“高熱病”也是由PRRSV變異株 (JXA1株) 引起的。

ORF7基因編碼的N蛋白具有高免疫原性和較好的保守性，至少含有5個(gè)抗原決定簇[1]，其中包括對(duì)美洲各型和歐洲各型的特異決定簇和所有毒株都保守的共同決定簇。由于這個(gè)特性，N蛋白能充當(dāng)PRRSV的檢測(cè)抗原，在PRRS的診斷方面有著十分重大的意義[2-3]。因此通過(guò)研究2001-2014年國(guó)內(nèi)部分毒株編碼ORF7基因可為研制 PRRSV 重組抗原和疫苗奠定理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)云南香豬體內(nèi)分離得到的PRRSV YN-2XZ1(GenBank序列號(hào)： 1776184) 和YN-3XZ2( GenBank序列號(hào)：1776193)毒株ORF7 基因進(jìn)行克隆與序列分析,并與 GenBank 中公布的國(guó)內(nèi)2001-2014年部分PRRSV 毒株的ORF7基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，為深入研究該毒株的遺傳變異及其生物學(xué)特性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源采集云南省6個(gè)自治州20只1月齡疑似PRRS癥狀的香豬，臨床出現(xiàn)雙眼腫脹、有眼屎，呼吸困難、消瘦、腹瀉、咳嗽、精神沉郁、食欲不振等癥狀，剖檢可見(jiàn)肺臟出血、腹股溝淋巴結(jié)明顯水腫出血等變化。

1.2 細(xì)胞及其他試劑Marc-145細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗、胰酶和PBS購(gòu)自Hyclone公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、EasyScript Reverse Transcriptase(M-MLV,RNaseH-)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；其他試劑由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 樣品處理取100 mg肺臟、50 mg淋巴結(jié)進(jìn)行混合研磨，加入2 mL PBS液進(jìn)行漩渦振蕩，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心30 min，取上清液1 mL加入100 μL雙抗，4℃靜止30 min。

1.4 病毒分離取500 μL樣品處理液加入長(zhǎng)至80%的Marc-145細(xì)胞中培養(yǎng)2 h，使用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行盲傳。第1代盲傳后凍融3次，80 000 r/min離心4 h，取500 μL加入長(zhǎng)至80%的Marc-145細(xì)胞中培養(yǎng)2 h，使用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行盲傳，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)。

1.5 分子生物學(xué)鑒定參考段博芳等[4]方法進(jìn)行ORF7基因PCR擴(kuò)增，P1：5′-AATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′;P2：5′-TCATGCTGAGGGTGATGCTG-3′，目的片段為330 bp。

1.5.1ORF7基因擴(kuò)增及克隆 使用DNA提取試劑盒提取組織樣品總DNA，根據(jù)PCR試劑說(shuō)明書(shū)優(yōu)化反應(yīng)體系及條件，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，上游和下游引物終濃度為0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板300 ng(1.5～2.0 μL)，加水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 3 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min 。取8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與適量上樣緩沖液混合后，在120 V電壓條件下用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，30 min后在凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)結(jié)果。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后與pMD18-T Vector進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。

1.5.2序列測(cè)定與分析 將鑒定為陽(yáng)性的菌種進(jìn)行測(cè)序分析，使用DNAStar和MEGA 4.0等生物學(xué)軟件分別對(duì)所獲得基因序列進(jìn)行位點(diǎn)突變和遺傳進(jìn)化分析，并與國(guó)內(nèi)外參考序列進(jìn)行比較并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，參考序列見(jiàn)表1。

表1 分析所用的PRRSV毒株參考序列及其來(lái)源

1.5.3磷酸化分析 使用在線NetPhos 2.0 Server軟件進(jìn)行磷酸化預(yù)測(cè)，以磷酸化概率大于等于50%為有效數(shù)值，低于50%為無(wú)效數(shù)值，預(yù)測(cè) ORF7基因編碼的氨基酸磷酸化的可能性，為開(kāi)發(fā)磷酸化抗體和基因突變研究提供理論依據(jù)。

1.5.4TCID50測(cè)定 取6孔細(xì)胞板中已長(zhǎng)至單層的Marc-145細(xì)胞,胰酶消化稀釋至1.0×105cell/mL的細(xì)胞懸液,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液100 μL,靜置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h，至細(xì)胞長(zhǎng)至96孔板的80%，用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對(duì)病毒原液進(jìn)行10倍倍比稀釋，以10-1～10-9梯度向Marc-145細(xì)胞中加入病毒液，每一稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù),每孔接種100 μL。設(shè)6個(gè)孔為正常對(duì)照。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，持續(xù)觀察120 h，結(jié)果按 Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.5.5免疫印跡(WB)鑒定 初始1×105cells/mL的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)60 h后，使用毒力為200 TCID50/100 μL的毒株YN-2XZ1和YUN-3XZ2毒株接毒培養(yǎng)48 h，此時(shí)出現(xiàn)50%CPE，用PRRSV CH-la株的核衣殼蛋白( N蛋白)單抗進(jìn)行WB試驗(yàn)。SDS配體膠60 V電泳70 min，90 V電泳40 min；60 V條件下使用0.22 μm PVDF膜，轉(zhuǎn)膜1 h，鼠源N蛋白單克隆一抗(1∶100)4℃孵育10 h，PBS洗滌(10 min/次)3次;羊抗鼠二抗(1∶4 000)常溫孵育2 h，PBS洗滌(10 min/次)4次，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)WB結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病毒致CPE觀察將處理過(guò)的病料接種于Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)至第2代48 h時(shí)出現(xiàn)典型CPE，細(xì)胞聚集成叢、 固縮、變圓、部分細(xì)胞緊縮呈索狀；72 h時(shí)表現(xiàn)為破碎、脫落(圖1)。正常細(xì)胞未見(jiàn)異常。

A.正常Marc-145細(xì)胞;B.YN-2XZ1毒株72 h CPE;C.YN-3XZ2毒株72 h CPE

2.2 分子生物學(xué)結(jié)果

2.2.1ORF7基因擴(kuò)增 細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)凍融3次后，提取總RNA，經(jīng)核酸定量后使用100 ng進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，用8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，YN-2XZ1、YN-3XZ2毒株P(guān)CR擴(kuò)增均在相近位置有1條帶，與預(yù)期330 bp相符(圖2)。

1.YN-2XZ1毒株P(guān)CR產(chǎn)物;2.YN-3XZ2毒株P(guān)CR產(chǎn)物;3.陰性對(duì)照;M.DL1000 DNA Marker

2.2.2免疫印跡(WB)鑒定 6孔板鋪滿80% Marc-145細(xì)胞時(shí)接種PRRSV 60 h，此時(shí)出現(xiàn)50%CPE。使用PBS洗滌的PRRSV CH-la株的核衣殼蛋白( N蛋白)單抗進(jìn)行WB試驗(yàn)可見(jiàn)YN-2XZ1和YN-3XZ2毒株均具有特異性的信號(hào),正常組檢測(cè)不到信號(hào)(圖3)。

圖3 PRRSV N蛋白WB檢測(cè)結(jié)果

2.2.3TCID50結(jié)果 使用96孔細(xì)胞板接種細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)120 h后，按Reed-Muench法計(jì)算得出YN-2XZ1毒株的半數(shù)細(xì)胞感染力106.75TCID50/100 μL，YN-3XZ2毒株的半數(shù)細(xì)胞感染力106.05TCID50/100 μL。

2.2.4ORF7基因重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 將切膠回收純化的ORF7基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(330 bp)在4℃條件下經(jīng)過(guò)12 h連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，用50 ng重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到2個(gè)大小分別為2 700,382 bp的目的片段，與預(yù)期相符，提示成功獲得重組質(zhì)粒(圖4)。

1.YN-2XZ1毒株重組質(zhì)粒酶切;2.YN-3XZ2毒株重組質(zhì)粒酶切；M.DL1000 DNA Marker

2.2.5ORF7基因同源性分析 測(cè)序結(jié)果顯示，試驗(yàn)獲得的2株P(guān)RRSV ORF7基因長(zhǎng)度為330 bp，編碼110個(gè)氨基酸。利用生物學(xué)軟件DNAStar對(duì)所獲得的2株P(guān)RRSV ORF7基因序列與其他國(guó)內(nèi)30條序列進(jìn)行核苷酸同源性分析。結(jié)果表明，此次從香豬體內(nèi)分離出的YN-2XZ1和YN-3XZ2毒株之間ORF7基因同源性為99.7%。YN-2XZ1毒株與國(guó)內(nèi)2001-2014年參考序列核苷酸同源性為95.2%～100.0%，其中與2001-2005年參考序列核苷酸同源性分別為96.1%(CH-1a，2001),95.2%(CH2002，2002),95.2%(CH2003，2003),95.2%(CH2004，2004);與2006-2014年參考序列核苷酸同源性為98.5%～100.0%，與經(jīng)典的美洲VR-2332毒株核苷酸同源性為94.0%。YN-2XZ2毒株與國(guó)內(nèi)2001-2014年參考序列核苷酸同源性為94.9%～100.0%，與2001-2005年參考序列核苷酸同源性分別為95.8%(CH-1a，2001),94.9%(CH2002，2002),94.9%(CH2003，2003),94.9%(CH2004，2004);與2006-2014年參考序列核苷酸同源性為96.7%～100.0%，與經(jīng)典的美洲VR-2332毒株序列核苷酸同源性為93.7%。

2.2.6遺傳進(jìn)化分析 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示,國(guó)內(nèi)毒株在2002-2004年與CH-1a毒株在一個(gè)分支，2005-2014年毒株在一個(gè)分支，均與美洲毒株VR-2332處于不同分支。本次獲得的2株P(guān)RRSV與國(guó)內(nèi)流行的變異PRRSV毒株ORF7基因進(jìn)化同步(圖5)。

圖5 PRRSV ORF7基因遺傳進(jìn)化分析

2.2.7ORF7基因氨基酸突變分析 將獲得的2株P(guān)RRSV ORF7基因編碼的氨基酸序列和1999年公布的VR-2332毒株及我國(guó)2001-2014年公布的序列翻譯的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比較(表2)。YN-2XZ1毒株和YN-3XZ2毒株ORF7基因編碼的氨基酸無(wú)差異，與CH-1a毒株ORF7基因編碼的氨基酸相比32位存在賴氨酸替換為精氨酸，35位存在絲氨酸替換為組氨酸，77位存在蘇氨酸替換為丙氨酸，99位存在組氨酸替換為谷氨酰胺，103位存在纈氨酸替換為丙氨酸。

CH-1a毒株與國(guó)內(nèi)2002-2014年毒株ORF7基因編碼的氨基酸相比25位賴氨酸在2005年替換為精氨酸，32位賴氨酸在2006年、2007年、2009年、2011-2014年替換為精氨酸(R)，35位絲氨酸在2006-2014年替換為天冬酰胺，40位天冬氨酸在2005-2014年替換為組氨酸，55位精氨酸在2002-2004年替換為脯氨酸，75位蘇氨酸在2011年替換為丙氨酸，77位蘇氨酸在2005-2014年替換為丙氨酸，95位組氨酸在2006-2007年、2009-2014年替換為谷氨酰胺，103位纈氨酸替換為丙氨酸。

CH-1a毒株與美洲毒株ATCCVR-2332 ORF7基因編碼的氨基酸相比35位天冬酰胺替換為絲氨酸(表2)。

2.2.8N蛋白磷酸化分析 見(jiàn)表3。使用在線軟件NetPhos 2.0 Server對(duì)參考序列及本次分析毒株序列進(jìn)行磷酸化預(yù)測(cè)得出：2001-2005年22,35,63,85,103位絲氨酸有67.4%～99.8%的概率被磷酸化；45,54位蘇氨酸有50.1%～93.6%概率被磷酸化，說(shuō)明這5個(gè)位點(diǎn)極易發(fā)生突變。2006-2014年35位絲氨酸磷酸化概率低于50%，趨于穩(wěn)定。

表2 ORF7基因片段中發(fā)生置換的氨基酸

3 討論

本試驗(yàn)成功從香豬體內(nèi)分離出2株P(guān)RRSV，均具有較高的致細(xì)胞病變效應(yīng)，第2次傳代即可造成Marc-145 細(xì)胞CPE，第2代細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行半數(shù)細(xì)胞感染力測(cè)定，按Reed-Muench法得出YN-2XZ1毒株的半數(shù)細(xì)胞感染力106.75TCID50/100 μL，YN-3XZ2毒株的半數(shù)細(xì)胞感染力106.05TCID50/100 μL。2006年童光志等[6-9]從全國(guó)12個(gè)省市48個(gè)疑似PRSS發(fā)病豬場(chǎng)采集的樣品研究表明，2006年前PRRSV分離毒株必須經(jīng)原代巨噬細(xì)胞(PAM)傳代后才能適應(yīng)Marc-145細(xì)胞，從而產(chǎn)生顯著CPE。在2006年暴發(fā)HP-PRRSV時(shí)分離出的15株P(guān)RRSV在Marc-145細(xì)胞上第1代盲傳即可產(chǎn)生CPE，隨后在我國(guó)分離的PRRSV毒株均表現(xiàn)出不需PAM細(xì)胞傳代，盲傳1～5代直接適應(yīng)Marc-145細(xì)胞。本試驗(yàn)從香豬體內(nèi)分離的PRRSV YN-2XZ1和YN-3XZ2毒株需經(jīng)1次傳代才能適應(yīng)Marc-145細(xì)胞，產(chǎn)生CPE，致病力相對(duì)2006年HP-PRRSV顯著下降，提示云南香豬群體中PRRSV可能不具有高暴發(fā)性和高致病力，不會(huì)引起重大經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)恐慌，但仍需對(duì)此加以關(guān)注。豬是PRRSV的唯一宿主，目前主要以疫苗接種來(lái)進(jìn)行預(yù)防，免疫失敗是造成PRRSV大規(guī)模流行和重大經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。范阿春等[11-13]對(duì)云南省PRRSV的血清學(xué)及危害情況進(jìn)行調(diào)查分析得出云南省PRRSV免疫后抗體陽(yáng)性率為82.76%～100.0%，表明云南省PRRSV免疫狀況較好，暴發(fā)大規(guī)模PRRSV的可能性較小，與本研究的推斷相同。但是由于香豬飼養(yǎng)時(shí)間短，免疫接種情況較差，因此仍然面臨PRRSV的威脅，并有可能傳染給大規(guī)模飼養(yǎng)的家豬，造成重大經(jīng)濟(jì)損失的可能性依然存在，因此需要對(duì)香豬PRRSV感染狀況進(jìn)行關(guān)注，以防止其散毒并造成家豬的大規(guī)模感染。

表3 ORF7基因編碼氨基酸磷酸化分析(磷酸化概率) %

對(duì)CH-1a毒株與2006-2014年HP-PRRSV毒株序列分析得出：CH-1a毒株55位精氨酸替換為脯氨酸，77位蘇氨酸替換為丙氨酸，103位纈氨酸替換為丙氨酸；使用CH-1a毒株制備的單克隆N蛋白抗體進(jìn)行WB試驗(yàn)，仍然可以檢測(cè)到目的條帶，提示55，77，103位氨基酸的替換不影響使用WB的方法檢N蛋白。使用在線軟件NetPhos 2.0 Server對(duì)ORF7基因編碼的氨基酸進(jìn)行磷酸化分析得出：參考毒株和此次分離毒株的54位蘇氨酸和85位絲氨酸磷酸化可能性高于90%，有較高的突變可能性，因此該位點(diǎn)具備較高的可能性通過(guò)定點(diǎn)突變獲得單克隆磷酸化抗體，可以用于區(qū)別野毒株和疫苗毒株[13-15]。

2005年前N蛋白35位絲氨酸磷酸化概率為67.4%～99.8%，2006-2014年N蛋白35位絲氨酸磷酸化概率低于50%，在2006年國(guó)內(nèi)暴發(fā)HP-RRSV至今，各省份主要流行HP-PRRSV，提示該位點(diǎn)氨基酸不易于磷酸化可能與 NSP-2蛋白基因缺失從而引起HP-RRSV有關(guān)[16-18]，但需要進(jìn)一步研究證實(shí)。N蛋白中含有類似于核定位信號(hào)(nuclear localzation signal，NLs ) 的保守的堿性決定簇。2009年李吉達(dá)等[19]對(duì)遼寧、吉林、河北、山東、河南、江蘇、浙江、廣西等省PRRS疫情進(jìn)行跟蹤調(diào)查，并分離出11株P(guān)RRSV毒株，通過(guò)分析指出N蛋白Pat7基序的突變可能會(huì)影響PRRSV的核定位，與本研究結(jié)果有相近之處，需要進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

本試驗(yàn)對(duì)及時(shí)掌握PRRSV ORF7基因的遺傳變異，了解N蛋白免疫原性和疫苗保護(hù)效率，為有效研發(fā)新疫苗及臨床用疫苗的選擇等提供了理論依據(jù)，并為全面預(yù)防和控制本病提供支持。隨著人們對(duì)生活質(zhì)量的重視與生活品質(zhì)的追求，以及地方品種資源的開(kāi)發(fā)，云南省及國(guó)內(nèi)其他省市的香豬數(shù)量將會(huì)在未來(lái)顯著增加，因此很有必要對(duì)存在于香豬群體中的PRRSV毒株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，以了解流行狀況和基因變異，對(duì)目前最為有效的疫苗預(yù)防方式提供高效的選擇依據(jù)具有重要的實(shí)際意義與參考價(jià)值。