鮑 芳，秘清靈，徐靜雯，王 昱，吳劍梅，王志仙，王建業(yè)，朱國強

( 揚州大學 獸醫(yī)學院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)屬于細小病毒科細小病毒亞科依賴細小病毒屬。MDPV基因組為一條線性單股DNA，以相等的極性存在于病毒粒子中[1]?；蚪M的兩側翼是由約450個堿基構成的末端倒置重復序列(inverted terminal repeats,ITR)，ITR可形成回文發(fā)夾結構并充當基因組復制的起始點[2-3]?；蚪M中間包含兩個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，左側ORF編碼非結構蛋白Rep，受P9啟動子調控，通過對mRNA的選擇性剪切可生成Rep1以及其他幾個相對分子質量更小的Rep蛋白[4]。右側ORF編碼結構蛋白Cap，受P41啟動子調控，通過對mRNA選擇性剪切以及起始密碼子的選擇性使用，可生成3個結構蛋白VP1、VP2和VP3，以約1∶1∶8的比例共同組成病毒衣殼[5]。

MDPV病是我國番鴨養(yǎng)殖業(yè)的一個重要疫病，主要發(fā)生在3周齡內雛番鴨，故俗稱為番鴨“三周病”，患病番鴨表現為喘氣、軟腳、腹瀉、運動失調，其發(fā)病率可達27%～62%，病死率為20%～55%[6]。20世紀80年代該病在我國首先報道[7]，后來法國、日本等國家也有報道[8-9]。

除了經典MDPV病以外，自20世紀90年代以來，在我國浙江、福建等番鴨養(yǎng)殖區(qū)還廣泛報道過一種稱之為“番鴨小鵝瘟”的疫病，該病特征性的解剖病理變化是在腸道出現類似小鵝瘟病例中的栓塞內容物，無論發(fā)病率還是致死率都要高于經典的“三周病”[10]。2018年浙江寧波某養(yǎng)殖場的7日齡番鴨暴發(fā)了一起疫病，病死率近60%，剖解死亡番鴨的腸道可見典型的栓塞，通過接種番鴨胚分離到1株病毒。本研究中，對該株病毒的基因組進行了測序和重組分析，結果表明該毒株為1株重組型的MDPV，表現在基因組的主體骨架，包括ITR和Rep基因均來自經典型MDPV，而在其VP3基因中間約1.1 kb區(qū)域以及P9啟動子區(qū)整合了鵝細小病毒(GPV)的序列。

1 材料與方法

1.1 病毒MDPV NY18株分離于2018年，由本實驗室于-75℃凍存。

1.2 生物學試劑Primestar Max高保真聚合酶，T4DNA連接酶，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，pMD19-T載體均購自大連寶生物工程有限公司；限制性內切酶購自NEB公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。

表1 用于擴增NY18株基因組的引物和擴增片段大小

1.3 引物設計參照MDPV ZW株基因組序列(GenBank登錄號KY744743)，合成了6對引物(表1)，這些引物擴增片段相互重疊，覆蓋MDPV完整基因組，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 病毒核酸提取N18株病毒核酸提取參照文獻[11]進行。DNA沉淀用30 μL去離子水溶解，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴增和測序PCR擴增體系為50 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，Primestar Max高保真聚合酶混合物25 μL，再用21 μL去離子水補齊。PCR循環(huán)條件：按照15 s/kb建立延伸反應，擴增30個循環(huán)。取5 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照。確認PCR產物陽性后，將剩余PCR產物全部上樣進行瓊脂糖凝膠電泳后，切取目的條帶，直接送商業(yè)化測序公司測序。對末端的約190 bp擴增片段則通過建立加“A”反應，再克隆入pMD19-T載體后進行測序。

1.6 序列比較和同源重組分析采用DNAStar軟件包中的SeqMan程序對測序結果進行拼接獲得完整基因組序列，用MegAlign程序中的Clustal W方法進行比對分析。采用Simplot 3.5.1和RDP4軟件進行重組分析，MEGA-X 軟件構建遺傳進化樹。

2 結果

2.1 基因組擴增和序列分析采用PCR分段擴增策略，以NY18株基因組為模板，成功擴增出預期的6個片段。PCR擴增產物經純化后直接測序或克隆至T載體后測序，經SeqMan軟件拼接后，獲得了完整基因組序列。NY18株基因組由5 071個堿基組成，與經典型MDPV FZ91-30(GenBank登錄號KT865605)和YY(GenBank登錄號KX000918)株相比，NY18株在5′和3′端ITR處分別缺失28和2個堿基，但這些缺失堿基均處于互補位置，不影響余下堿基配對形成發(fā)夾結構。

2.2 重組分析采用Simplot 3.5.1 和RDP4軟件一致檢測到NY18株基因組產生了兩處重組事件，其中較大范圍的重組事件產生在VP3基因中間約1.1 kb范圍內，該重組以經典型MDPV YY株為主要親本，以經典型GPV 強毒株 DY16株(GenBank登錄號為MH209633)為次要親本。RDP4軟件顯示該次重組的斷裂起始點在3 120堿基，斷裂終止點在 4 251堿基處(圖1)。第2個重組事件產生在5′ ITR的P9啟動子區(qū)至Rep基因起始密碼子ATG下游約100個堿基處，同樣以經典型MDPV YY株為主要親本，而以GPV鵝胚化弱毒疫苗株SYG61v為次要親本。RDP4顯示重組斷裂起始點在 424 堿基，斷裂終止點在615堿基處。

a.Simplot 3.5.1軟件所做的重組分析；b.RDP4 軟件所做的重組分析

2.3 ITR及編碼蛋白序列分析基因組5′端和 3′端的ITR完全一致，均由424個堿基組成，其中外側385個堿基形成回文發(fā)夾結構。5′ ITR的D區(qū)序列由39個堿基組成，和3′ ITR的D′區(qū)序列反向互補。NY18株的ITR與經典型MDPV FM和YY株的同源性分別為97.9%和99.1%，明顯高于與GPV強毒株YZ99-6的同源性(86.0%)，表明其ITR 仍來自于經典型MDPV。

NY18株Rep1基因與經典型GPV毒株DY16和LH株的同源性均為83.3%，而與經典型MDPV FM、YY株的同源性分別為98.8%和99.0%，表明Rep1基因序列來自經典型MDPV。NY18株VP1基因與經典型GPV毒株DY16、LH株的同源性分別為90.1%和89.4%，與MDPV FM、YY株的同源性分別為89.3%和89.1%，表明NY18株的VP1基因與經典型GPV和MDPV毒株之間享有基本相等的核苷酸同源性，這一結果與產生在VP1基因內部的重組事件相吻合。通過對VP1蛋白氨基酸序列的進一步比對顯示，NY18株在發(fā)生重組的同時，還分別在450,461,485,489,548,585,712位產生了7個特征性氨基酸點突變，這些位點的氨基酸既不同于經典MDPV毒株，也不同于經典GPV毒株，為NY18株所特有。

2.4 基于基因組不同區(qū)域的遺傳進化樹根據重組分析的結果，以重組區(qū)和非重組區(qū)序列分別構建遺傳進化樹。結果顯示，以Rep基因C端1 774 bp和VP1基因N端694 bp和C端405 bp分別構建遺傳進化樹，NY18株均與經典型MDPV毒株處于同一分支(圖2a、b、c)。以VP1基因1 100 bp的重組區(qū)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，NY18株則與經典型GPV毒株處于同一分支(圖2d)?；蜻M化樹結果與前述重組分析的結果也完全一致。

a.Rep基因羧基端1 774 bp；b.VP1基因氨基端694 bp；c.VP1基因羧基端405 bp；d.VP1基因重組區(qū)1 100 bp片段

3 討論

重組型MDPV在臨床上具有兩個特點，一是相較于經典型MDPV，可對較高日齡的番鴨致病，對雛番鴨呈現出更高的病死率；二是在雛番鴨感染死亡的臨床病例中，可見腸道出現栓塞。NY18株分離于2018年暴發(fā)的一起番鴨病例，事實上，自20世紀90年代中期開始，特別是在浙江省，類似的以腸道栓塞為特征的病例就多有報道[10]；這表明盡管這一時期已有經典的MDPV活疫苗在田間使用，但對NY18株類似的病毒株感染明顯缺乏保護力，致使這一類型毒株一直在田間流行，持續(xù)威脅我國番鴨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

重組是病毒快速進化的一種手段，可以使病毒株獲得新的抗原性，從而逃避原有疫苗的保護得以在田間持續(xù)傳播。VP3是MDPV和GPV的主要結構蛋白[5,12-13]。在1.1 kb的VP3重組區(qū)，NY18 株共有33個氨基酸位點與經典型MDPV不一致，而與GPV毒株一致。此外，我們還發(fā)現，在重組之外，NY18株在VP1 的7個氨基酸位點產生了特有的點突變，這些位點既不同于經典型MDPV，也不同于GPV，其中6個突變位點均產生在1.1 kb的重組區(qū)，1個(712位)產生在VP1的羧基末端。因此，點突變和重組共同塑造了NY18株的結構蛋白序列組成，使之成為一個高適配性的重組型MDPV，能夠在一個較長的時間持續(xù)在中國的番鴨群中流行。

NY18株的ITR與經典型MDPV毒株高度同源，顯示其來源于經典型MDPV，因而與同樣來自經典型MDPV的Rep蛋白的互作不會受到減弱。SYG61v株是一個鵝胚傳代減弱的毒株，可在雛鵝上使用防制GPV病[14-15]，具有特征性的P9啟動子序列。NY18株在此處與SYG61v株產生了重組，并且這次重組區(qū)域延伸到Rep1閱讀框上游100 nt處，一個特征性結果是Rep1的第3位氨基酸不同于經典型MDPV(P→T)，而與GPV一致。一個相對毒力減弱的P9啟動子在重組型MDPV致病性中的意義尚需要進一步深入研究。

總之，本研究揭示了NY18株作為重組型MDPV的分子特征。已有資料顯示，這類毒株已在安徽省的番鴨養(yǎng)殖區(qū)流行[16]，鑒于這類毒株已對番鴨養(yǎng)殖業(yè)所造成的經濟損失，開展針對該類毒株的分子流行病學監(jiān)控以及開發(fā)基于重組型MDPV毒株的弱毒活疫苗研究顯得十分重要。