林委衛(wèi)，陳雪明，李晨曦，白小飛，劉 明，張 云

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069)

鴨坦布蘇病毒(DTMUV)是黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒。該病毒家族還包括登革熱病毒(DENV)、西尼羅河病毒(WNV)、日本腦炎病毒(JEV)、蜱媒腦炎病毒(TBEV)、寨卡病毒(Zika virus)等重要媒介傳播人畜共患病毒，這些病毒常引起嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率，黃病毒的流行仍然是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。

黃病毒感染后，動物產(chǎn)生特異性和交叉反應(yīng)性兩種類型抗體。交叉反應(yīng)性抗體會引發(fā)3個具有公共衛(wèi)生意義的問題。首先，交叉反應(yīng)抗體使得血清學(xué)診斷無法識別被感染的病毒，特別是當(dāng)發(fā)生不同的黃病毒感染時。其次，交叉反應(yīng)抗體可能通過抗體依賴性增強(ADE)導(dǎo)致更嚴(yán)重的黃病毒繼發(fā)感染，特別是繼發(fā)性DENV、WNV和ZIKV感染[1-2]。第三，交叉反應(yīng)抗體所致的ADE又引發(fā)了人們對黃病毒疫苗研發(fā)的擔(dān)心。最近暴發(fā)的ZIKV使黃病毒疫苗的研發(fā)更加困難和復(fù)雜，因為無論在體內(nèi)還是體外，抗DENV、WNV和ZIKV的抗體已被證明能夠彼此間發(fā)生交叉反應(yīng)，且這些抗體能增強其他黃病毒的感染或復(fù)制[1-2]。因此，了解E蛋白交叉反應(yīng)表位對于提高公眾對這些病毒的認(rèn)識至關(guān)重要。

DTMUV對鴨的產(chǎn)蛋量[3-4]有毀滅性的影響。DTMUV是黃病毒科黃病毒屬的一員，其E蛋白氨基酸序列與JEV(66.0%)、WNV(65.3%)、ZIKV(53.0%)、DENV(45.3%)、黃熱病病毒(44.3%)和TBEV(41.1%)具有高度的相似性。DTMUV在老鼠動物模型中表現(xiàn)出年齡依賴性的神經(jīng)侵襲，并介導(dǎo)ADE疾病感染的嚴(yán)重性[5]。

與其他黃病毒一樣，DTMUV基因組編碼1個多聚蛋白，在宿主和病毒蛋白酶作用下裂解成3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白[6]。黃病毒E蛋白是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護性抗體的主要抗原，在膜融合和介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體結(jié)合過程中起至關(guān)重要作用[7]。因此，黃病毒E蛋白直接影響病毒的宿主范圍、組織嗜性和毒力。其他黃病毒E蛋白和表位的X射線晶體學(xué)分析表明，E蛋白包含3個典型結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅰ[DⅠ]、DⅡ和DⅢ)。

前期利用單克隆抗體3B6、1F3和1A5，已經(jīng)成功鑒定出表位374ExE/DPPFG380、221LD/NLPW225和87YAEYI91 [8-9]。黃病毒E蛋白具有保護性免疫功能，鑒于其產(chǎn)生難以區(qū)分的交叉反應(yīng)性抗體，給血清診斷帶來嚴(yán)重困難。此外，交叉反應(yīng)抗體還通過ADE增加繼發(fā)性黃病毒感染后疾病的嚴(yán)重性。因此，鑒定交叉反應(yīng)表位對于了解血清診斷和提高黃病毒感染ADE相關(guān)問題的認(rèn)知至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑單克隆抗體1G2由本實驗室制備保存[10]；日本乙型腦炎病毒(JEV)由上海獸醫(yī)研究所童光志研究員惠贈。pGEX-6P-1、pET30a和pCDNA3.1質(zhì)粒、感受態(tài)大腸桿菌DH 5α及感受態(tài)細(xì)胞BL 21(DE3)均購自寶生物(TaKaRa)公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自New England Bio Labs 公司；T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量試劑盒購自 Axygen 公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自KPL公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量Marker購自MBI公司；DAB顯色液購自北京中杉金橋公司。

1.2 中和試驗(PRNT)利用Protein G親和層析柱對1G2進行純化,非中和的同型對照單抗1B11作為陰性對照。將純化的單克隆抗體1G2連續(xù)10倍稀釋與約100 PFU的DTMUV混合，并在37℃孵育1 h，然后將混合物(200 μL/孔)添加到BHK-21細(xì)胞單層中，孵育1 h。去除上清，然后將含有1%低熔點瓊脂糖的DMEM(含4%的FBS)鋪于細(xì)胞上,再培養(yǎng)4 d后，用TrueBlue (KPL，Gaithersburg，MD，USA)進行染色，記錄噬斑數(shù)。

1.3 抗原表位的篩選參考文獻[11]所述的原核表達菌系統(tǒng)，表達了來自DTMUV E蛋白的一系列截短肽。利用人工合成的6對針對重疊截短E蛋白基因(命名P1-P6)設(shè)計引物，利用EcoRⅠ/XhoⅠ限制性位點(表1)將其克隆到帶有His標(biāo)簽的pET30a(Novagen，Madison，WI)載體中。為了進一步精確地定位表位，將位于E蛋白221～235 aa的多肽進一步合成6個部分重疊肽的多肽基因(命名為P7-P12)，并將其克隆到帶有GST標(biāo)簽的pGEX6p-1載體中。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)細(xì)胞，在37℃下用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，用Western blot檢測各肽對1G2的免疫反應(yīng)。

1.4 關(guān)鍵氨基酸位點的確定為了精確定位MAb 1G2結(jié)合的關(guān)鍵殘基，根據(jù)最小表位GSSAGTWQN的序列，用逐個氨基酸定點突變的方法，設(shè)計合成相應(yīng)多肽的寡核苷酸序列(表2)。在互補的2條寡核苷酸鏈中，正義鏈5′-端引入XhoⅠ酶切位點，反義鏈5′-端引入EcoRⅠ酶切位點。2條互補的寡核苷酸鏈，退火后可形成雙鏈的DNA，可直接與EcoRⅠ和XhoⅠ酶切處理的pGEX-6P-1載體連接，得到重組質(zhì)粒測序驗證。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)細(xì)胞，在37℃下用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，用Western blot檢測各個突變肽對1G2的免疫反應(yīng)。以融合表位肽P11(GST-GSSAGTWQN)和肽N(GST-YIRTPACWD，番鴨呼腸孤病毒σB蛋白表位肽)[11]為陽性對照和陰性對照。

表1 克隆截短E蛋白所用引物

表2 克隆表達突變氨基酸表位多肽所用引物

1.5 Western blot 分析將測序正確的重組質(zhì)粒進行誘導(dǎo),表達后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移到纖維硝酸素(NC)膜上；用5%脫脂乳(PBS)4℃封閉過夜，PBS洗3遍，每遍5 min；以1∶1 000倍稀釋的單抗1G2作為一抗，37℃孵育1 h;PBST(0.1% Tween-20)洗3遍，每遍5 min；然后1∶2 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG作為二抗，37℃孵育1 h;PBST(0.1% Tween-20)洗3遍，每遍5 min；DAB顯色觀察結(jié)果。

1.6 表位交叉反應(yīng)性分析采用免疫熒光法(IFAs)檢測1G2對DTMUV、JEV、ZIKV和WNV的交叉反應(yīng)性。人工合成WNV(Ew)和ZIKV(Ez)的E編碼基因。參考DTMUV E蛋白真核表達方法[12]，將合成基因克隆到pCDAN3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNA-Ew和pCDNA-Ez。在6孔板中80%融合的BHK21細(xì)胞感染DTMUV或JEV(0.001 MOI)，或參考DTMUV E蛋白的真核表達方法[12]，轉(zhuǎn)染pCDNA-Ew或pCDNA-Ez。感染或轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞在DMEM中于37℃孵育48～72 h。細(xì)胞于4℃在10%福爾馬林中固定過夜，用70%乙醇滲透20 min，并在免疫染色前用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。以單克隆抗體1G2或正常小鼠血清稀釋300倍作為陰性對照。37℃孵育1 h后，用PBST洗滌細(xì)胞3次。然后用FITC結(jié)合抗鼠IgG(KPL)200倍稀釋液在37℃下處理細(xì)胞0.5 h，并用PBS沖洗。然后用2 mg/L Hoechst染色，在室溫下染色10 min，并用PBST清洗5次后，用共聚焦熒光顯微鏡檢測陽性細(xì)胞。

1.7 E蛋白的結(jié)構(gòu)分析由于DTMUV E蛋白與JEV具有62%的序列同源性，因此DTMUV的模型可依據(jù)JEV的jeveprotein(PDB-ID:3P54)[13]的晶體結(jié)構(gòu)模型。即利用PyMOL[14]中的quat.py(https://pymolwiki.org/index.php/biolocalunit/quat)建立基于JEV包裝對稱性的成熟DTMUV病毒模型。1G2表位的假定構(gòu)象是由MODELLER等[15]中的完全模擬退火分子動力學(xué)過程生成的。從100個獨立生成的模型中，選擇10個勢能最低的模型進行進一步的分析。1G2表位的均方根波動(RMSF)由pymol中的RMSF_states.py腳本(http://pldserver1.biochem.queensu.ca/～rlc/work/pymol/)計算。用POPS(32)計算了DTMUV E蛋白在殘留水平上的極性。

2 結(jié)果

2.1 單抗1G2中和活性和最小表位的確定用PRNT法測定純化的1G2對DTMUV的中和活性。結(jié)果表明，PRNT50質(zhì)量濃度為(0.32±0.07) mg/L時，單克隆抗體1G2能有效中和DTMUV，而對照單克隆抗體1B11不能中和DTMUV。為了確定1G2的最小表位，使用單克隆抗體1G2和E蛋白的表達重疊肽(表1)進行了Western blot。多肽P1、P2、P3、P5、P6、P7、P8、P9、P11和PE被1G2識別(圖1)；P4、P10、P12和陰性對照(Pc1和Pc2)不被1G2識別。結(jié)果表明，1G2只與含有特定氨基酸序列GSSAGTWQN的多肽反應(yīng)，而與截短的缺少G或N的多肽以及陰性對照肽(Pc1或Pc2)不發(fā)生反應(yīng)。1G2只與含有特定氨基酸序列核心GSSAGTWQN [P11(227～235 aa)] 的肽反應(yīng)，證實GSSAGTWQN是1G2識別所需的最小氨基酸序列。

M.蛋白Marker;P1～P12.表1截短的E蛋白片段；PE.表達的E蛋白;Pc1,Pc2.pET30a 和 pGEX6p-1表達的陰性對照

2.2 關(guān)鍵氨基酸殘基鑒定通過Western blot檢測1G2對突變重組肽的反應(yīng)性來確定關(guān)鍵氨基酸位點。當(dāng)表位重組肽中的氨基酸發(fā)生突變時：即Ser229Thr(S229T)、Gly231Ala(G231A)、Thr232-Ser(T232S)和Trp233Phe(W233F)，Western blot(圖2)顯示，S229T和T232S的突變對1G2的反應(yīng)性沒有任何影響，而G231A和W233F的突變則消除了與1G2的反應(yīng)性。接下來當(dāng)表位肽氨基酸發(fā)生單一突變Gly227Ala(G227A)、Ser228Ala(S228A)、Gln234Ala(Q234A)、Asn235 Thr(N235-T)和Ala230Thr(A230T)以及Gly231Ser(G231S)和Trp233Tyr(W233Y)時，Western blot結(jié)果顯示，G227A、S228A、Q234A和N235T的突變對1G2的反應(yīng)性沒有影響；但是發(fā)生Gly231(G231S)和Trp233(W233Y)的突變時，完全消除了表位與1G2的反應(yīng)性。結(jié)果表明，W233(W233F/W233Y)或Gly231(G231A/G231S)的突變消除了與1G2的結(jié)合，證實W233和Gly231是1G2與表位結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點。

M.蛋白Marker;m1～m11.表2中突變表位肽；P11 (GST-GSSAGTWQN)，N (GST-YIRTPACWD).分別用作陽性和陰性對照

2.3 1G2對DTMUV、JEV、WNV和ZIKV中E蛋白的識別為了進一步確定1G2是否能與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA-Ew和pCDNA-Ez或感染DTMUV或JEV的BHK-21細(xì)胞表達的E蛋白抗原結(jié)合，進行了免疫熒光分析(圖3)。用熒光共聚焦顯微鏡觀察，1G2在轉(zhuǎn)染或病毒感染的細(xì)胞中均表現(xiàn)出特征性的胞漿綠色熒光，而未感染細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)綠色熒光(略)，表明1G2是識別DTMUV、JEV、WNV和ZIKV的交叉反應(yīng)性抗體。

2.4 表位定位DTMUV E蛋白單體包含3個結(jié)構(gòu)域(圖4A)。1G2識別表位位于DⅡ的hi環(huán)(h和i鏈之間)(圖4A)。hi環(huán)是DⅡ中段凹槽的一部分。229S、232T和233W的側(cè)鏈面向DⅡ的上表面，228S和230A的側(cè)鏈面向DⅡ的外表面(圖4B)。然而，233W的大芳香側(cè)鏈被來自鏈a、d和h的殘基包圍，因此其極性降低。盡管234Q和235N被預(yù)測為E蛋白二聚體上的暴露殘基，但它們的側(cè)鏈面向病毒膜(圖4B，C)，因此，成熟的DTMUV粒子上的這2個殘基無法被抗體識別(圖4D)。

3 討論

通過使用Western blot和重疊肽篩選策略，成功地鑒定了最小表位227GSSAGTWQN235。如IFA所示，1G2與JEV感染或pCDNA-Ew/Ez轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞中的E蛋白反應(yīng)，證實GSSAGTWQN是DTMUV、JEV、WNV和ZIKV的交叉反應(yīng)表位。僅231G或233W突變就破壞了1G2與JEV、WNV和ZIKV E蛋白的結(jié)合，提示231G和233W是這些黃病毒的交叉反應(yīng)性表位關(guān)鍵氨基酸位點。氨基酸W233在黃病毒中是完全保守的，包括DTMUV、JEV、ZIKV、WNV、YFV、DENV1-4、MVEV和SLEV。已經(jīng)報道1B7-5、6B6C-1和4G2多個單抗識別DⅡ[16]融合環(huán)上的一組重疊表位(G104/G106/G107/E126/T226和W233)，考慮到1G2識別E蛋白中的關(guān)鍵氨基酸G231和W233，1G2表位代表了DⅡ hi環(huán)上一種新的交叉反應(yīng)性中和抗原表位。DTMUV E蛋白結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)分析表明，表位GSSAGTWQN，包括2個關(guān)鍵氨基酸G231和W233，均暴露在成熟病毒粒子表面，構(gòu)成一個新的構(gòu)象表位。

圖3 免疫熒光方法對單抗1G2與DTMUV、JEV、WNV和ZIKV交叉反應(yīng)的鑒定(單抗1G2與Hoechst對感染DTMUV 和JEV 或轉(zhuǎn)染 pCDAN-Ew 和 pCDAN-Ez 后的BHK-21 細(xì)胞表達的E蛋白后的共定位熒光檢測)

A.DTMUV E 蛋白二聚體(DTMUV E 單體有3個結(jié)構(gòu)域：DⅠ (洋紅色)，DⅡ(黃色),DⅢ (藍色)，彩色球代表表位(GSSAGTWQN)中的氨基酸，229S、231G和233W 分別用橙色、藍色和紅色表示，2個預(yù)測的N-糖基化位點用天藍色球表示)；B.DTMUV E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅱ(1G2表位用橙色枝條表示，融合環(huán) (FL)綠色表示，二硫鍵用黃色枝條表示)；C.DTMUV E 蛋白二聚體側(cè)面圖(229S、231G和233W分別用橙色、藍色和紅色表示)；D.1G2表位殘基(紅色)在成熟的DTMUV偽原子模型圖中的定位

除JEV、MVEV或SLEV外，大多數(shù)黃病毒都含有G231氨基酸，包括表位區(qū)的DTMUV、ZIKV、WNV、YFV、DENV1-4、MVEV和SLEV。由于缺乏側(cè)鏈，231G在抗體識別中不可能起作用，然而，它可能對環(huán)結(jié)構(gòu)(或表位結(jié)構(gòu))的形成起重要作用。231G殘基不保守，但許多黃病毒E蛋白需要在該環(huán)域中的1個或2個甘氨酸來形成β-轉(zhuǎn)(YFV有3個甘氨酸)。對于那些環(huán)中沒有甘氨酸的E蛋白(JEV、SLEV和MVEV)，可能需要脯氨酸殘基來形成β-轉(zhuǎn)角，這意味著231G對于功能表位的結(jié)構(gòu)完整性非常重要，而殘基本身不是用來識別的[17-18]；這也表明1G2識別天然的E蛋白單體僅在非還原條件下，但不與變性和還原的E蛋白結(jié)合。

總之，本研究鑒定了黃病毒一個新的交叉反應(yīng)性表位，為DTMUV和其他黃病毒E蛋白表位的結(jié)構(gòu)、功能以及表位疫苗的研究提供了新的見解。此外，本研究還可以提高人們對黃病毒血清診斷中出現(xiàn)的交叉反應(yīng)問題的認(rèn)知。