余海立 張 彥* 張鳳偉 張海波 程 倩 陳智仙 董運海 李婉奕 張雙慶

(1.安琪酵母股份有限公司，酵母功能湖北省重點實驗室，宜昌443003；2.中國疾病預防控制 中心營養(yǎng)與健康所，北京100050)

硒是人和動物必需的微量元素，機體攝入硒不足時，腦是最后出現(xiàn)缺硒的器官，硒對維持神經(jīng)系統(tǒng)生理功能發(fā)揮重要作用[1]。Babür等[2]研究發(fā)現(xiàn)，給予21 d缺硒飼糧導致大鼠空間學習能力降低。Sharma等[3]研究發(fā)現(xiàn)，缺硒引起小鼠大腦皮質(zhì)中鐵含量升高和認知功能下降。人群調(diào)查表明體內(nèi)硒水平隨著年齡的增加顯著降低，硒水平與認知功能存在正相關(guān)，缺硒會引起認知功能下降，進而引起阿爾茲海默癥、帕金森癥等神經(jīng)疾病的發(fā)生[4]。

L-絲氨酸是人體非必需氨基酸，參與核酸和蛋白質(zhì)代謝，可促進脂肪酸代謝、肌肉生長與神經(jīng)細胞鞘合成，在調(diào)節(jié)機體健康中發(fā)揮重要生物學功能[5]。L-絲氨酸經(jīng)絲氨酸消旋酶轉(zhuǎn)化合成D-絲氨酸，D-絲氨酸是動物體內(nèi)水平較高的D型氨基酸之一，廣泛存在于血液、視網(wǎng)膜、腦部組織中，作為神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[6]。D-絲氨酸是機體必需的功能性氨基酸，在氧化應激、免疫、神經(jīng)性疾病等過程中發(fā)揮重要的生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默癥模型小鼠腦中D-絲氨酸水平顯著升高，阿爾茲海默癥患者腦脊液中D-絲氨酸水平顯著升高，D-絲氨酸被認為是阿爾茲海默癥的一種新型生物標志物[7]。Mickiewicz等[8]研究發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6小鼠32周的低硒飼糧會引起血清中絲氨酸水平顯著升高。Yim等[9]研究表明，給予C57BL/6J小鼠5周缺硒飼糧會引起肝臟中絲氨酸水平顯著下降，對大腦中絲氨酸水平無顯著影響。上述研究結(jié)果表明缺硒可引起絲氨酸代謝水平的變化，但未明確是D-絲氨酸還是L-絲氨酸。

臨床研究發(fā)現(xiàn)補硒對阿爾茲海默癥、帕金森癥、小腦萎縮癥等神經(jīng)退行性疾病具有良好的預防和治療作用[10]。硒可以降低脂質(zhì)過氧化反應，減少淀粉樣蛋白的聚集，降低Tau蛋白的過度磷酸化并抑制神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，改善小鼠的認知功能障礙[11]。目前，長期缺硒對大腦D-絲氨酸、L-絲氨酸水平的影響，以及體內(nèi)缺硒和足硒時補硒對機體尤其是腦部D-絲氨酸、L-絲氨酸水平影響的研究還未見報道。本試驗在前期研究[12]的基礎(chǔ)上，建立長期缺硒大鼠模型，旨在研究以富硒酵母形式補充不同劑量硒112 d對缺硒和正常大鼠血漿、大腦皮質(zhì)、海馬中D-絲氨酸、L-絲氨酸水平的影響，明確體內(nèi)硒水平與D-絲氨酸、L-絲氨酸水平的關(guān)系，為確證D-絲氨酸是否為硒改善認知功能損傷的生物標志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗用Sprague-Dawley大鼠購自三峽大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2017-0012。選取3周齡Sprague-Dawley大鼠120只，隨機分為缺硒組(n=75)和對照組(n=45)。缺硒組飼喂低硒飼糧(含0.02 mg/kg硒)，正常組飼喂正常飼糧(含0.18 mg/kg硒)，飼喂期為420 d。第1～60天使用AIN-93G型飼糧，試驗第61～420天使用AIN-93M型飼糧，飼養(yǎng)期間缺硒組死亡6只，正常組死亡5只。試驗第421天，將缺硒組大鼠分成4組：缺硒空白對照組(SD-B組，n=17)、缺硒富硒酵母低劑量組(SD-LY組，n=16)、缺硒富硒酵母中劑量組(SD-MY組，n=20)、缺硒富硒酵母高劑量組(SD-HY組，n=16)。將正常組大鼠分為2組：正?？瞻讓φ战M(SS-B組，n=20)、正常富硒酵母中劑量組(SS-MY組，n=20)。SD-B組繼續(xù)飼喂低硒飼糧，SD-LY、SD-MY、SD-HY組分別飼喂含0.18、0.36和0.72 mg/kg硒的富硒酵母飼糧，SS-B組繼續(xù)飼喂正常飼糧，SS-MY組飼喂含0.36 mg/kg硒的富硒酵母飼糧，飼喂期為112 d。大鼠低硒飼糧按照AIN-93標準配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。正常飼糧和富硒酵母飼糧是在低硒飼糧的基礎(chǔ)上分別添加亞硒酸鈉和富硒酵母，具體試驗設(shè)計見表2。大鼠實行分籠飼養(yǎng)，控制環(huán)境溫度在(20±2) ℃，相對濕度在55%～65%，自由飲食。

表1 低硒飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

表2 試驗設(shè)計

1.2 試驗材料與儀器

主要材料：富硒酵母，硒含量為2 104 mg/kg。

主要儀器：iCAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，美國賽默飛世爾科技公司)、Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫安捷倫科技有限公司)。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 樣品采集

試驗第532天后，將大鼠用乙醚麻醉，眼靜脈叢取血，肝素鈉抗凝，1 520×g離心10 min，取血漿，-80 ℃保存，用于血漿硒水平的測定；斷頭后迅速在冰盤上分離皮質(zhì)、海馬、小腦，-80 ℃保存，用于硒以及D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的測定；分離心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸等器官，濾紙吸干后稱量并記錄，并計算器官指數(shù)。

1.3.2 生長性能與器官指數(shù)測定

試驗開始和結(jié)束時以及每隔30 d測定各組大鼠體重。器官指數(shù)計算公式如下：

器官指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100。

1.3.3 硒水平測定

用0.5%硝酸將100 μL血漿稀釋至2.0 mL，混勻離心后取上清過濾，得到待測液，參照余海立等[12]的方法測定硒水平。腦組織經(jīng)微波消解，定容至50 mL，即為待測液，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定硒水平。飼糧硒水平參照GB/T 13883—2008《飼料中硒的測定》中的氫化物原子熒光光譜法測定。

1.3.4D-絲氨酸和L-絲氨酸水平測定

血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，取上清，氮氣吹干，衍生化后得到待測液，參照余海立等[12]方法測定D-絲氨酸、L-絲氨酸水平。稱取一定量的海馬、大腦皮質(zhì)，加入甲醇低溫下研磨，離心后取上清，氮氣吹干，衍生化后得到待測液，采用高效液相色譜法測定D-絲氨酸和L-絲氨酸水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行分析，缺硒組和正常組之間差異顯著性采用t檢驗分析。補硒試驗中的各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重

由圖1可知，低硒飼糧飼喂60 d后，缺硒組大鼠體重顯著低于正常組大鼠(P<0.05)。補硒112 d后，各組大鼠體重無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，缺硒會使大鼠生長發(fā)育緩慢，體重降低；補硒可使缺硒大鼠體重恢復正常。

2.2 器官指數(shù)

由表3可知，各組間心臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。與SD-B組相比，SD-LY組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，SS-MY組肝臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01)。

“*”表示與缺硒組相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與缺硒組相比差異極顯著(P<0.05)。

表3 飼糧硒水平對大鼠器官指數(shù)的影響

2.3 硒水平

2.3.1 血漿硒水平

由圖2可知，與SS-B組相比，SD-B組大鼠血漿硒水平顯著降低(P<0.05)。與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY和SD-HY組血漿硒水平顯著升高(P<0.05)，與SS-B組相比，SS-MY組血漿硒水平無顯著變化(P>0.05)，說明通過在飼糧中添加富硒酵母補硒，可使缺硒大鼠血漿硒水平恢復到正常水平。

圖2 飼糧硒水平對大鼠血漿硒水平的影響

2.3.2 大腦皮質(zhì)和小腦硒水平

由圖3可知，SD-B和SS-B組大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平無顯著差異(P>0.05)，說明飼喂低硒飼糧對大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平無顯著影響(P>0.05)。與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY、SD-HY和SS-MY組大腦皮質(zhì)硒水平極顯著升高(P<0.01)，SD-LY組小腦硒水平略有升高(P>0.05)，SD-MY、SD-HY和SS-MY組小腦硒水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，說明通過在飼糧中添加富硒酵母補硒，可顯著提高大鼠大腦皮質(zhì)和小腦中硒水平，且呈劑量依賴。

圖3 飼糧硒水平對大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平的影響

2.4 D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

2.4.1 血漿D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

由圖4可知，與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY組血漿L-絲氨酸水平顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，血漿D-絲氨酸水平無顯著變化(P>0.05)，說明長期缺硒使大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，補硒可以使其恢復到正常水平。

圖4 飼糧硒水平對大鼠血漿D-絲氨酸和

2.4.2 大腦皮質(zhì)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

由圖5可知，與SD-B組相比，SD-LY組大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平顯著降低(P<0.05)，SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY組大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平也有所降低，但差異不顯著(P>0.05)。與SD-B組相比，SD-LY和SD-MY組大腦皮質(zhì)D-絲氨酸水平降低，SD-HY、SS-B和SS-MY組大腦皮質(zhì)D-絲氨酸水平升高，但差異均不顯著(P>0.05)。

圖5 飼糧硒水平對大鼠大腦皮質(zhì)D-絲

2.4.3 海馬D-絲氨酸和L-絲氨酸水平

由圖6可知，與SD-B組相比，SD-HY組海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平極顯著升高(P<0.01)，SD-MY組海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平也有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，SD-LY、SS-B和SS-MY組海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平無顯著變化(P>0.05)，說明飼糧中添加高劑量富硒酵母可以顯著升高大鼠海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平。

圖6 飼糧硒水平對大鼠海馬D-絲氨酸和

3 討 論

3.1 富硒酵母對大鼠體內(nèi)硒水平和生長發(fā)育的影響

血漿硒水平是反映體內(nèi)硒營養(yǎng)狀態(tài)的指標。田俊梅等[13]認為血清硒水平降低為270 ng/mL，大鼠處于低硒狀態(tài)。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼喂缺硒飼糧420 d后，大鼠血漿硒水平為159 ng/mL，說明缺硒大鼠造模成功。Sharma等[3]研究發(fā)現(xiàn)，給予BALB/c小鼠低硒、足硒、過量硒飼糧24周，低硒組小鼠大腦皮質(zhì)硒水平顯著下降，小腦硒水平未見顯著變化；過量硒組小鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平未見顯著變化。Akahoshi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6J小鼠為期6周的低硒飼糧(含硒0.026 mg/kg)，1周后小鼠心臟、肝臟、腎臟等臟器硒水平顯著下降，4周后大腦硒水平顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠缺硒飼糧532 d，缺硒大鼠大腦皮質(zhì)和小腦硒水平未出現(xiàn)顯著變化，這與上述缺硒小鼠的研究結(jié)果不一致，可能與種屬不一致有關(guān)，有待進一步研究。硒通過硒蛋白發(fā)揮重要生理功能，硒蛋白脫碘酶調(diào)節(jié)三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)水平，T3、T4調(diào)節(jié)甲狀腺激素的分泌，因此長期缺硒可能通過影響脫碘酶活性引起動物生長發(fā)育緩慢[15]，本研究發(fā)現(xiàn)缺硒60 d后缺硒組大鼠體重增長顯著放緩，Amer等[16]發(fā)現(xiàn)通過補硒可以得到改善。

3.2 富硒酵母對大鼠體內(nèi)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的影響

L-絲氨酸是機體所需的一種氨基酸，在不同階段發(fā)揮不同的生理功能，主要參與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核苷酸、神經(jīng)遞質(zhì)等的合成，同時也是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可轉(zhuǎn)化為D-絲氨酸和甘氨酸，兩者均為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸傳遞、突觸可塑性和興奮性毒性的調(diào)節(jié)，并且D-絲氨酸還在大腦發(fā)育、學習和記憶等生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。現(xiàn)有研究表明長期缺硒使小鼠血清絲氨酸水平增加[8]，肝臟絲氨酸水平降低，對大腦絲氨酸水平無顯著影響[9]，但未明確是D-絲氨酸還是L-絲氨酸。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長期缺硒對大鼠血漿、小腦D-絲氨酸、L-絲氨酸水平無顯著影響[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，長期缺硒大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平升高，海馬L-絲氨酸水平無顯著變化，血漿、大腦皮質(zhì)和海馬D-絲氨酸水平無顯著變化。與前期研究[13]相比，本研究延長了缺硒時間，發(fā)現(xiàn)大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，可能是長期飼喂缺硒飼糧引起體內(nèi)硒水平下降，影響硒蛋白的合成，L-絲氨酸為硒蛋白合成提供碳骨架，硒蛋白合成降低可能引起血漿L-絲氨酸水平的升高。此外，L-絲氨酸具有抗氧化活性，L-絲氨酸水平的增加可能是機體應對硒水平下降引起的氧化應激的增加。進行補硒后發(fā)現(xiàn)，與SD-B組相比，SD-LY、SD-MY和SD-HY組血漿L-絲氨酸水平顯著降低。這可能是由于補硒顯著提高血漿硒水平，使硒蛋白合成增加，消耗大量L-絲氨酸，造成血漿L-絲氨酸水平下降。大鼠長期缺硒后海馬L-絲氨酸水平未出現(xiàn)顯著變化，補充高劑量硒后海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平顯著升高，這可能是由于L-絲氨酸不能通過血腦屏障，大腦利用葡萄糖從頭合成大量L-絲氨酸以滿足硒蛋白合成的生理需要[18]，引起海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平升高。與SS-B組相比，缺硒532 d大鼠皮質(zhì)L-絲氨酸水平升高，但無顯著差異，補充低劑量硒后L-絲氨酸水平顯著降低，恢復至SS-B組水平。缺硒大鼠大腦皮質(zhì)L-絲氨酸水平增加可能是機體應對缺硒引起的氧化應激水平增加，補硒使大腦皮質(zhì)硒水平升高，進而使得L-絲氨酸水平恢復正常。

4 結(jié) 論

① 補硒使缺硒大鼠體重恢復正常，并可顯著提高大鼠血漿、大腦皮質(zhì)、小腦硒水平。

② 長期缺硒使大鼠血漿L-絲氨酸水平顯著升高，但對大腦皮質(zhì)、海馬L-絲氨酸水平無顯著影響，血漿、大腦皮質(zhì)、海馬D-絲氨酸水平也無顯著影響。

③ 以富硒酵母形式補硒，飼糧硒水平為0.18、0.36和0.72 mg/kg時可顯著降低缺硒大鼠血漿L-絲氨酸水平，飼糧硒水平為0.72 mg Se/kg時還可顯著升高缺硒大鼠海馬L-絲氨酸和D-絲氨酸水平。