王曦齡 李 軍 李思源 高 群 王 雙

1 新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科(石河子 832000) 2 新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院(石河子 832000) 3 上海楊浦區(qū)中心醫(yī)院(上海 200000)

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)是由多種病因引起的一組以胰島素抵抗、胰島素分泌不足引起糖代謝紊亂、長期高血糖狀態(tài)為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。T2DM 是一種具有復(fù)雜病因的綜合癥，其發(fā)病與種族人群、先天遺傳及環(huán)境改變、膳食結(jié)構(gòu)相關(guān)[2]。而糖尿病合并骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)近年來頻繁出現(xiàn)在糖尿病合并慢性并發(fā)癥患者的關(guān)注中。它以骨量降低、在持續(xù)病因影響下無法維持正常骨小梁等骨組織微結(jié)構(gòu)、進(jìn)一步加劇骨的脆性，造成骨折等意外事件為特征的全身代謝性疾病。這是老年人骨折最常見的原因。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，骨質(zhì)疏松發(fā)生率在老年人和絕經(jīng)后女性中明顯增高。其中，骨密度(BMD)下降是脆性骨折的主要原因[3]。在骨質(zhì)疏松的眾多致病條件中，遺傳一直是國內(nèi)外專家關(guān)注的重要因素[4]。近年來國內(nèi)外專家致力于發(fā)現(xiàn)并研究骨質(zhì)疏松癥候選基因的推想與實(shí)驗(yàn)，同時，一部分研究結(jié)果提示了在原發(fā)性骨質(zhì)疏松復(fù)雜的病理機(jī)制中，遺傳因素即基因多態(tài)性或基因突變占有重要地位，證實(shí)基因多態(tài)性在原發(fā)性骨質(zhì)疏松病因中起了重要作用[5- 6]。女性絕經(jīng)后發(fā)生骨質(zhì)疏松主要原因是卵巢衰老功能降低，雌激素分泌低水平，成骨細(xì)胞功能減弱或降低，破骨細(xì)胞數(shù)目增加，兩者之間失去正常的平衡狀態(tài)，加速成骨細(xì)胞凋亡，引起骨轉(zhuǎn)移、骨吸收加強(qiáng)，造成骨量減少發(fā)展成骨質(zhì)疏松。糖尿病作為一種由遺傳和環(huán)境等復(fù)雜多因素相互作用而引起的物質(zhì)代謝性紊亂疾病，國內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)了糖尿病患者存在脂質(zhì)代謝異常，并同時提出了糖尿病性骨質(zhì)疏松癥等亞臨床疾病狀態(tài)[7]。本研究將對新疆石河子地區(qū)2型糖尿病絕經(jīng)后女性LRP5基因該兩個位點(diǎn)基因多態(tài)性及突變與糖、脂、骨代謝關(guān)系，為新疆絕經(jīng)后女性2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料與診斷標(biāo)準(zhǔn)

從新疆石河子地區(qū)2016年10月—2017年10月社區(qū)及住院的絕經(jīng)后女性中選取入組對象，根據(jù)患者病史、糖耐量試驗(yàn)及骨密度測定結(jié)果分為四組：糖耐量正常與骨量正常組(A組)，糖耐量正常與骨量異常組(B組)，T2DM與骨量正常組(C組)，T2DM與骨量異常組(D組)。該研究在醫(yī)學(xué)倫理委員會的監(jiān)督下，入組人員皆簽字知情同意文書后開展本實(shí)驗(yàn)。

其中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1999年WHO推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)。BMD的判斷標(biāo)準(zhǔn)符合1994年WHO推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)。血液標(biāo)本及信息收集均獲患者的知情同意。納入無特殊原因絕經(jīng)后、完全行事能力人、神志清、說話流暢的女性；排除患有特殊類型糖尿病及1型糖尿病及其他引起骨質(zhì)疏松等疾病的女性。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床生化指標(biāo)的測定：由實(shí)驗(yàn)研究員使用調(diào)查問卷形式記錄入組對象的姓名、年齡、絕經(jīng)年限、糖尿病病史、骨質(zhì)疏松癥及其他代謝性疾病病史，采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對研究對象進(jìn)行身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍等資料的測量并登記。按照體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI),等于體質(zhì)量除身高平方(kg/m2)得到體質(zhì)量指數(shù)，及計算腰圍與臀圍的比值，得到腰臀比。

1.2.2 一般生化指標(biāo)的測定：選取1管靜脈血采用羅氏全自動生化分析儀(型號Modular DPP-H7600)測定： FPG 等糖代謝指標(biāo)；測定TG、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等脂代謝指標(biāo)；測定血Ca、血P、ALP等骨組織代謝指標(biāo)；同時，高壓液相色譜法(HPLC)測定糖化血紅蛋白(HbAlc)數(shù)值。雙能X線吸收法測定腰椎1- 4及股骨頸骨密度(BMD)。

1.2.3 LRP5基因DNA提?。翰捎檬茉囌咄庵苎? mL，提取DNA的步驟按照天根生化科技有限公司使用說明，全血基因組DNA提取試劑盒，- 80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Sequenom飛行時間質(zhì)譜法測定LRP5基因rs3736228、rs3781586多態(tài)性：首先在UCSC網(wǎng)站查閱到SNP數(shù)據(jù)庫上關(guān)于LRP5基因該兩個位點(diǎn)的堿基序列和長度。順利完成引物設(shè)計是需要Assay Design 3.0 Software(Sequenom Mass 公司)生物技術(shù)對兩個位點(diǎn)設(shè)計引物，(具體引物序列如下)。打開PCR檢測儀，設(shè)置PCR各項(xiàng)步驟；使用Sequenom飛行時間質(zhì)譜法測定LRP5基因rs3736228、rs3781586的基因突變情況。步驟：引物設(shè)計，PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物純化，單堿基延伸反應(yīng)，上機(jī)檢測。以下為具體引物序列：

rs3736228:上游引物(F):5′-AGTGCGATGACCAGAGCG- 3′

下游引物(R):5′-TGGTGGGACAGGATGGGTG- 3′

Rs3781586:上游引物(F):5′-CCGTAAGCAGAGGGGACATT- 3′

下游引物(R): 5′-ATGGCACTGCTGAGGTGACTGT- 3′

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1.1 組間基線情況的比較 A、B、C、D四組研究對象的年齡、絕經(jīng)年限、體質(zhì)量指數(shù)、腰臀比等一般觀察情況，見表1。

表1 組間基線情況比較

與A組比較，B組及D組的年齡(B組P=0.046；D組P=0.001)及絕經(jīng)年限(B組P=0.027,<0.05；D組P=0.006,<0.01)均大于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，一般基線資料不齊，故采用協(xié)方差分析除外年齡及絕經(jīng)年限對以下結(jié)果的影響。

2.1.2 組間糖代謝、骨代謝、脂代謝生化指標(biāo)的比較 經(jīng)協(xié)方差分析后A、B、C、D四組研究對象的FBG、HbAlc、TG、HDL-C、LDL-C、Ca、P、ALP、L1- 4BMD、股骨頸BMD等各項(xiàng)觀察指標(biāo)，見表2。

表2 組間生化指標(biāo)經(jīng)協(xié)方差分析后的比較

組間糖、脂、骨代謝及骨密度(BMD)指標(biāo)比較結(jié)果：與A組比較，C組、D組的糖代謝指標(biāo)FPG(C組P=0.005；D組P=0.001)、HbA1c(C組P=0.001；D組P=0.001)水平較高；B組、D組中脂代謝指標(biāo)TG(B組P=0.038;D組P=0.046)水平較低；B組、D組BMD(L1- 4)(B組P=0.001;D組P=0.009)、BMD(股骨頸)(B組P<0.001;D組P=0.003)水平較低。

2.2 LRP5基因rs3736228、rs3781586的基因多態(tài)性及基因突變分析

2.2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)：本研究中，與病例組相比，對照組人群更接近自然人群，故僅在對照組人群中進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)。新疆石河子地區(qū)絕經(jīng)后女性該兩個位點(diǎn)基因型A組經(jīng)過遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果：rs3736228位點(diǎn)：χ2=0.629，P=0.427；rs3781586位點(diǎn)χ2=0.465，P=0.495。說明本研究所選擇的研究人群能夠代表目標(biāo)人群，具有較好的人群代表性。

2.2.2 LRP5基因組間基因型及等位基因分布頻率：新疆石河子地區(qū)絕經(jīng)后女性該兩個位點(diǎn)組間基因型及等位基因分布頻率未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.3 LRP5基因突變與骨、糖、脂代謝的關(guān)系

2.3.1 不同組間LRP5基因rs3736228位點(diǎn)不同基因型之間代謝指標(biāo)的比較：由于TT型的研究對象少，所以將TT型與CT型整合成TT/CT(突變型)后與CC型(野生型)比較分析。A組LRP5基因rs3736228位點(diǎn)基因型之間基線指標(biāo)的比較(P>0.05)，基線齊同，具有可比性。A組，與CC型(野生型)相比， CT/TT型(突變型)甘油三酯(TG)降低(P=0.026)，BMD(L1- 4)降低(P=0.046)；其他各項(xiàng)代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。C組LPR5基因rs3736228位點(diǎn)基因型之間基線指標(biāo)的比較(P>0.05)，基線齊，有可比性。C組，與CC型(野生型)相比，CT/TT型(突變型)高密度脂蛋白(HDL-C)升高(P=0.003)，磷(P)升高(P=0.038)；其他各項(xiàng)代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。B組中各項(xiàng)代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。D組中各項(xiàng)代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 A組LRP5基因rs3736228基因型之間骨、糖、脂代謝指標(biāo)的比較

表4 C組LRP5基因rs3736228基因型之間骨、糖、脂代謝指標(biāo)的比較

2.3.2 不同組間LRP5基因rs3781586位點(diǎn)不同基因型之間代謝指標(biāo)的比較：由于TT型的研究對象少，所以將TT型與GT型整合成TT/GT(突變型)后與GG型(野生型)比較分析。B組LRP5基因rs3781586位點(diǎn)基因型之間基線指標(biāo)的比較(P>0.05)，基線齊，有可比性。B組，與GG型(野生型)相比，GT/TT(突變型)高密度脂蛋白(HDL-C)升高(P=0.038)；其他各項(xiàng)代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。A、B、D組中各項(xiàng)代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 B組LRP5基因rs3781586基因型之間骨、糖、脂代謝指標(biāo)的比較

3 討 論

依據(jù)最新的中國流行病學(xué)調(diào)查可知，國人糖尿病總患病率高達(dá)9.7%，平均每10個中國人便有1個是糖尿病患者。糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率已達(dá)到60%以上，該病受包括遺傳、環(huán)境、吸煙、過量飲酒、低鈣飲食等多種因素在內(nèi)的影響，在發(fā)病趨勢上存在隨著年齡增加而增加的特征[8]。隨著人口老齡化進(jìn)程逐漸加速，年齡因素在骨質(zhì)疏松癥中的發(fā)生、發(fā)展的影響日益突出，老年人患病率顯著增加，OP及骨質(zhì)疏松性骨折已成為現(xiàn)代社會不可忽視的公共健康衛(wèi)生問題。兩者起病隱匿，無論是長期高血糖狀態(tài)還是骨量降低，臨床癥狀不明顯，患者無法及時醫(yī)院就診，明確診斷，造成治療延誤錯過最佳時機(jī)[9]。人類低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5基因在染色體上的位置為11q12-13，LRP5基因表達(dá)產(chǎn)物為跨膜受體蛋白[10]，目前國內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)LRP5基因與T2DM、OP相關(guān)，也有研究提出LRP5作為共受體參與WNT經(jīng)典信號通路調(diào)節(jié)骨代謝的機(jī)制假設(shè)[11]。故國內(nèi)外學(xué)者考慮將LRP5基因的多態(tài)性及突變作為參與2型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥代謝性轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路中備選基因之一[12]，而LRP5基因多態(tài)性及突變與2型糖尿病及2型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的研究在國內(nèi)外報道尚不明確。

在探討LRP5基因與T2DM及OP的關(guān)系中，通過高通量時間飛行時間質(zhì)譜法檢測，發(fā)現(xiàn)新疆石河子地區(qū)絕經(jīng)后女性2型糖尿病LRP5基因rs3736228、rs3781586位點(diǎn)高頻等位基因頻率分別是：0.786和0.814，這與日本、韓國等亞洲蒙古人種保持一致，而與白種人卻存在明顯的差異性。同時，發(fā)現(xiàn)該兩個位點(diǎn)基因型分組中野生型純合子基因型最多，突變型雜合子基因型次之，突變型純合子基因型最少。本研究中將對照組與病例組相比，糖耐量正常與骨量正常組人群更接近理想自然人群，故使用遺傳平衡檢驗(yàn)對照組人群的遺傳性情況。本研究發(fā)現(xiàn)新疆石河子地區(qū)絕經(jīng)后女性群體該兩個位點(diǎn)基因頻率和基因型頻率的遺傳規(guī)律基本符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。說明本研究所選擇的研究人群具有相對穩(wěn)定的遺傳性，能夠較好的代表目標(biāo)人群。與正常對照組(即糖耐量正常伴骨量正常組)相比，T2DM伴骨量正常組、糖耐量正常伴骨量異常組、T2DM伴骨量異常組位點(diǎn)基因型頻率分組無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。研究結(jié)果提示，該兩個位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與新疆絕經(jīng)后女性糖代謝紊亂沒有關(guān)聯(lián)。但本研究發(fā)現(xiàn)LRP5基因該兩個位點(diǎn)在絕經(jīng)后女性中的基因突變可能與TG水平降低、HDL水平升高、P水平升高、BMD水平降低有關(guān)，進(jìn)一步說明LRP5基因該兩個位點(diǎn)的基因的突變可能與該地區(qū)人群中脂、骨代謝有關(guān)，參與了2型糖尿病患者脂代謝紊亂及合并OP的發(fā)生發(fā)展。

目前2型糖尿病合并OP是一種常見病、多發(fā)病，尤其是在絕經(jīng)后女性中發(fā)病機(jī)制的研究尚不明確。本研究表明LRP5基因在糖代謝、骨代謝中扮演著重要角色，該基因rs3736228、rs3781586位點(diǎn)的突變在新疆石河子絕經(jīng)后2型糖尿病女性中可能參與了骨質(zhì)疏松、脂代謝紊亂的發(fā)生、發(fā)展，關(guān)于Wnt信號通路相關(guān)蛋白LRP5的基因多態(tài)性突變，在未來的實(shí)驗(yàn)研究中還需進(jìn)一步擴(kuò)大人群范圍，全面篩查影響基因的其他因素，從而通過較為先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室測量方法及完善的統(tǒng)計學(xué)分析來揭示LRP5基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)系，為糖尿病合并骨質(zhì)疏松的防治提供新的理論依據(jù)。