林慧晶，吳 瓊，陳冠楠，陳 榮，林 多

（醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省光子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建師范大學(xué)，福州 350007）

外泌體是胞內(nèi)體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外的脂質(zhì)雙層囊泡，直徑大約在30～150 nm，廣泛分布于血液、尿液、唾液、羊水、母乳和腹水等體液中。外泌體最早是Johnstone等［1］在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中發(fā)現(xiàn)的。外泌體最初被認(rèn)為只是細(xì)胞的“垃圾袋”，用于清除不必要的成分，這導(dǎo)致與其相關(guān)的研究沉寂了二十多年。直到2007年，Valadi等［2］首次報(bào)道外泌體也含有核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），并對(duì)其組成和功能進(jìn)行了深入的研究，使得外泌體成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。現(xiàn)如今我們知道，外泌體攜帶著其來源細(xì)胞的各種分子成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、信使RNA（mRNA）和非蛋白質(zhì)編碼小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）等（圖1），可以在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，因此被視為細(xì)胞間通信的一種重要模式［3］。越來越多的證據(jù)表明，癌癥衍生的外泌體可以轉(zhuǎn)移致癌活性并調(diào)節(jié)血管生成、免疫和轉(zhuǎn)移，以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［4-9］。外泌體作為細(xì)胞間信息傳遞的載體，存在于各種體液中，尤其是在疾病標(biāo)志物篩選中起了重要的作用［10-11］。因此，外泌體是一種極具潛力的非侵入性癌癥篩查、癌癥進(jìn)展評(píng)估和治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。

圖1 外泌體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structure of exosomes

目前，外泌體的檢測(cè)技術(shù)［12-14］主要包括：透射電鏡、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Western blot， WB）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)以及基因測(cè)序技術(shù)。這些分析技術(shù)極大地推動(dòng)了外泌體的研究進(jìn)程，但也存在著一些局限：ELISA需要大量高度濃縮的樣品，無法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本的快速分析［15］；納米顆粒跟蹤分析技術(shù)對(duì)外泌體濃度的測(cè)量范圍有限（每毫升只有106到109個(gè)）［16-17］；流式細(xì)胞術(shù)分析外泌體可能存在回收信號(hào)弱等問題［18］；透射電鏡檢測(cè)、PCR與TamSeq二代測(cè)序技術(shù)則存在檢測(cè)費(fèi)用昂貴、操作步驟復(fù)雜、耗時(shí)等不足?？傊?，目前外泌體分析檢測(cè)仍然沒有“金標(biāo)準(zhǔn)”，因此，急需進(jìn)一步發(fā)展外泌體檢測(cè)新方法，加快癌癥體液活檢的發(fā)展進(jìn)程。

拉曼光譜是一種基于非彈性散射的分子光譜技術(shù)，能夠識(shí)別蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等生化物質(zhì)分子［19］。但在實(shí)際應(yīng)用中，目標(biāo)分子固有的拉曼散射截面極小，并且目標(biāo)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)，常常造成常規(guī)拉曼信號(hào)微弱，被淹沒在熒光信號(hào)中［20］。直到1974年，F(xiàn)leischmann等［21］科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）可以將吸附在粗糙金屬表面的待測(cè)物拉曼信號(hào)增強(qiáng)103～1015倍，實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)，同時(shí)還能淬滅生物樣品的自體熒光信號(hào)，極大地增強(qiáng)了拉曼光譜的信號(hào)。目前，科學(xué)界對(duì)SERS的增強(qiáng)機(jī)理還未給出一個(gè)清晰統(tǒng)一的解釋，普遍認(rèn)為SERS效應(yīng)是由物理增強(qiáng)與化學(xué)增強(qiáng)共同作用的結(jié)果［22-23］。物理增強(qiáng)主要是電磁場(chǎng)增強(qiáng)，分析物吸附或靠近粗糙的貴金屬表面時(shí)，受金屬表面等離子體共振導(dǎo)致局域電磁場(chǎng)增強(qiáng)?；瘜W(xué)增強(qiáng)由電荷轉(zhuǎn)移引起，分析物吸附或足夠靠近金屬表面，通過電荷轉(zhuǎn)移產(chǎn)生增強(qiáng)現(xiàn)象。盡管SERS的增強(qiáng)機(jī)理復(fù)雜尚需進(jìn)一步探索，但是SERS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，這歸功于SERS技術(shù)在生物樣品檢測(cè)方面具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：1）超高靈敏度，實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的痕量分析；2）不受水溶液信號(hào)的干擾，可檢測(cè)液體狀態(tài)下的樣品；3）有效淬滅生物樣品自體熒光，獲取高質(zhì)量拉曼光譜。SERS技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域［24］，如核酸、蛋白質(zhì)、人體細(xì)胞、人體組織以及人體體液的檢測(cè)。

近年來，人們開始嘗試將超高靈敏度的SERS技術(shù)用于外泌體的檢測(cè)，試圖發(fā)展一種高效、無損的液體活檢新技術(shù)［25］。基于SERS技術(shù)的外泌體檢測(cè)策略可分為兩種：一種是無需引入拉曼探針的非標(biāo)記SERS技術(shù)，直接獲得外泌體自身的拉曼信號(hào)，該方法的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單快速，可以更直接分析外泌體的成分，但各類生物分子的信號(hào)有可能互相重疊，造成部分診斷信號(hào)的丟失；另一種是標(biāo)記SERS技術(shù)，利用拉曼探針分子對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記，通過檢測(cè)標(biāo)記分子的拉曼強(qiáng)度，間接檢測(cè)外泌體的存在以及濃度，該方法常常有著更高的檢測(cè)靈敏度和特異性。本文主要介紹SERS在外泌體中的非標(biāo)記和標(biāo)記檢測(cè)的發(fā)展進(jìn)程，并且展望了SERS在外泌體中的應(yīng)用前景。

1 SERS技術(shù)對(duì)外泌體的非標(biāo)記檢測(cè)

非標(biāo)記檢測(cè)是將純化后的外泌體直接吸附或非?？拷黃ERS基底表面獲取外泌體的拉曼光譜信號(hào)。為了獲取理想的外泌體拉曼信號(hào)，需要制備高效的SERS增強(qiáng)基底。

2012年，Tirinato等［26］利用光刻技術(shù)刻蝕規(guī)則六角形圖案形成超疏水表面，用于檢測(cè)從正常結(jié)腸細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞分離出來的外泌體。超疏水表面可有效聚集液滴，與光學(xué)共振現(xiàn)象相結(jié)合，增強(qiáng)了SERS光譜信號(hào)。結(jié)果表明，從正常細(xì)胞中提取的外泌體呈現(xiàn)出與脂質(zhì)振動(dòng)相對(duì)應(yīng)的較高的峰值強(qiáng)度，而從腫瘤細(xì)胞系中提取的外泌體則表現(xiàn)出較豐富的RNA含量。超疏水表面將外泌體濃縮到基底的活性區(qū)域，方便了SERS對(duì)生物樣品進(jìn)行極精確的分析和表征。2015年，Lee等［27］利用濺射技術(shù)在3D納米碗表面涂覆一層銀膜作為SERS基底，用于檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的外泌體隨時(shí)間推移的SERS信號(hào)。這一3D納米碗用于檢測(cè)外泌體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：首先，與還原法制備的銀納米粒子相比，濺射等離子體表面具有更低的SERS背景信號(hào)；其次，外泌體在早期保持完整的形態(tài)，通過SERS可檢測(cè)外泌體膜表面的蛋白與脂質(zhì)，隨著碗內(nèi)的水分蒸發(fā)至干涸，外泌體破裂時(shí)，可檢測(cè)到外泌體內(nèi)容物的SERS光譜。2017年，該小組繼續(xù)開展相關(guān)研究［28］，利用表面修飾巰基肽配體的銀納米顆粒對(duì)具有α3?1高表達(dá)的卵巢癌外泌體進(jìn)行特異性捕獲。隨著靶向特異性配體庫的發(fā)展，該方法可以從富含外泌體的體液中選擇性地發(fā)現(xiàn)和分析目標(biāo)外泌體，是一項(xiàng)在早期疾病檢測(cè)方面極具潛力的技術(shù)。2017年，Sivashanmugan等［29］將銀納米立方體組裝在金納米棒陣列表面熱環(huán)直徑上形成等離子間隙模式SERS陣列底物來研究外泌體。他們利用所開發(fā)的SERS基底，研究了正常肺細(xì)胞和癌細(xì)胞的外泌體，發(fā)現(xiàn)肺癌外泌體的較強(qiáng)SERS信號(hào)主要是來源于蛋白質(zhì)，而正常外泌體的SERS信號(hào)主要來源于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物分子。同年，Miquel等［30］發(fā)現(xiàn)在常規(guī)記錄盤（CD-R和DVD-R）上涂覆薄銀層后可以顯著增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)，這主要與聚碳酸酯結(jié)構(gòu)、銀厚度和激發(fā)波長(zhǎng)有關(guān)。他們?cè)诮?jīng)過試驗(yàn)后獲得了無標(biāo)記的血紅蛋白和外泌體的SERS光譜，這表明了該方法的生物傳感潛力。該方法的最大優(yōu)勢(shì)是SERS基底制備簡(jiǎn)單、費(fèi)用低并且易于大規(guī)模制備。

以上介紹的外泌體SERS檢測(cè)平臺(tái)均是基于銀納米顆粒。而金納米粒子相對(duì)于銀納米粒子具有更好的生物相容性，基于金納米顆粒的外泌體SERS檢測(cè)在近年來也得到了顯著的發(fā)展。2014年，Laura等［31］應(yīng)用SERS技術(shù)初步研究了卵巢癌細(xì)胞在正常氧氣條件下和缺氧條件下的外泌體組成分差異。2016年，Stremersch等［32］制備了一種帶正電荷的金納米粒子，由于靜電吸附會(huì)使得金納米粒子與囊泡（囊泡包括外泌體）吸附在一起，增強(qiáng)拉曼信號(hào)。他們利用偏最小二乘法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）與多元曲線分辨率交替最小二乘法（multivariate curve resolution alternating least squares，MCR-ALS）分析算法分析得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)，能夠區(qū)分來自正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的囊泡。2017年，Park等［33］將SERS技術(shù)和統(tǒng)計(jì)算法相結(jié)合，發(fā)展了一種無標(biāo)記、高靈敏度的外泌體分類方法。此次試驗(yàn)以金納米粒子為SERS增強(qiáng)基底，采用主成分分析方法分別對(duì)肺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞分泌的外泌體的光譜進(jìn)行分析，判別靈敏度為95.3%，特異性為97.3%。2018年，Carmicheal等［34］利用非標(biāo)記SERS技術(shù)聯(lián)合主成分微分函數(shù)分析（principal component differential function analysis，PCDFA）算法對(duì)來源于胰腺癌和正常胰腺上皮細(xì)胞分泌的外泌體進(jìn)行區(qū)分，判別準(zhǔn)確率可達(dá)90%。他們進(jìn)一步將這種方法應(yīng)用于血清中外泌體的檢測(cè)分析，同樣獲得了理想的效果，有望發(fā)展一種胰腺癌早期檢測(cè)新方法。想要利用非標(biāo)記SERS檢測(cè)技術(shù)達(dá)到分辨外泌體的目的，除了需要制備具有顯著增強(qiáng)效果的SERS基底之外，還需要發(fā)展更高效的數(shù)據(jù)處理方法。2020年，Shin等［35］利用計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)對(duì)來自正常細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系的外泌體的SERS信號(hào)進(jìn)行了訓(xùn)練，并提取兩類外泌體光譜的特征后建模用于分析和預(yù)測(cè)人血漿來源外泌體的SERS光譜。該試驗(yàn)將外泌體的SERS光譜分析與深度學(xué)習(xí)相結(jié)合，成功地鑒定了肺癌患者，甚至發(fā)現(xiàn)了處于第一階段的病人。該方法無創(chuàng)、安全、靈敏，對(duì)肺癌早期液體活檢方法的發(fā)展具有重要意義。

非標(biāo)記SERS技術(shù)展示了外泌體自身的“指紋”圖譜后，再利用多元統(tǒng)計(jì)及計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)算法對(duì)其深入挖掘診斷信息并建立判別模型，最終實(shí)現(xiàn)區(qū)分和追溯不同來源的外泌體。當(dāng)前，非標(biāo)記SERS外泌體檢測(cè)技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化的過程中面臨重重困難，但是我們相信隨著外泌體研究樣本的數(shù)量的擴(kuò)大和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，該方法極有可能被廣泛用于臨床檢測(cè)中。

2 SERS技術(shù)對(duì)外泌體的標(biāo)記檢測(cè)

SERS標(biāo)記檢測(cè)是一種將SERS光譜技術(shù)與抗體抗原特異作用相結(jié)合的納米標(biāo)記免疫分析技術(shù)。SERS納米標(biāo)記是一類含有強(qiáng)烈拉曼信號(hào)的等離子體納米粒子。通過類似抗體抗原的特異反應(yīng)作用使得SERS納米標(biāo)記與目標(biāo)外泌體相結(jié)合形成“三明治”復(fù)合物，再通過檢測(cè)此復(fù)合物的拉曼標(biāo)記分子的拉曼強(qiáng)度，間接表征目標(biāo)分子的分布和濃度。常見的“三明治”結(jié)構(gòu)主要可以分為兩類：一類是“拉曼探針-外泌體-磁珠”（圖2），另一類是“拉曼探針-外泌體-芯片”（圖3）。

圖2 “拉曼探針-外泌體-磁珠”結(jié)構(gòu)類型示意圖［36］Fig. 2 Structural type diagram of“Raman probe-exosomes-magnetic beads”［36］

2.1 “拉曼探針-外泌體-磁珠”SERS檢測(cè)模型

通常，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌更多的外泌體，并且其膜表面有特殊的生物標(biāo)記物（主要是一些跨膜蛋白），這使得腫瘤源性外泌體成為一種重要的癌癥生物標(biāo)記物。因此，研究人員就利用腫瘤源性外泌體含有多種特異性蛋白的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一系列“拉曼探針-外泌體-磁珠”SERS檢測(cè)模型。如圖2所示，該方法通常使用兩種納米顆?！判约{米珠和SERS納米探針，且在兩種粒子表面修飾有兩種特異性抗體，可以單獨(dú)識(shí)別外泌體上的兩種不同的蛋白質(zhì)。在靶向外泌體的存在下，SERS納米探針、外泌體和磁性納米粒子之間形成了“三明治”型免疫復(fù)合物。在有磁鐵的情況下，免疫復(fù)合物可以沉淀，因此SERS納米探針將在沉淀中檢測(cè)到SERS信號(hào)。而在沒有靶向外泌體的情況下，由于不能形成免疫復(fù)合物，沉淀只有磁性納米顆粒，SERS信號(hào)幾乎檢測(cè)不到。這樣，SERS信號(hào)可以用來判別目標(biāo)外泌體的存在。近年來，越來越多的人發(fā)現(xiàn)標(biāo)記SERS在外泌體研究中的應(yīng)用潛力，其中“拉曼探針-外泌體-磁珠”SERS檢測(cè)模型引起了一大部分人的興趣。

圖3 “拉曼探針-外泌體-芯片”結(jié)構(gòu)類型示意圖［43］Fig. 3 Structural type diagram of“Raman probe-exosomes-chip”［43］

2016年，Zong等［36］提出了利用磁性納米粒子和核-殼結(jié)構(gòu)納米探針來識(shí)別和捕獲靶外泌體，形成“三明治”型免疫復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶外泌體的定性和定量檢測(cè)，其檢測(cè)極限比其他大多數(shù)報(bào)道的方法都要低。其中，磁性納米粒子是先在Fe3O4納米粒子表面包覆一層二氧化硅，然后在二氧化硅表面附著抗體制備而成的。拉曼探針是以銀包金納米棒（gold core-silver shell nanorods，Au@Ag NRS）為激發(fā)核，然后修飾上染料分子作為拉曼報(bào)道分子，再包裹上硅層，最后在硅層表面修飾抗體。該方法可以直接從細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)出外泌體，無需其他復(fù)雜的操作，且檢測(cè)極限低于其他報(bào)道的方法。因此，與現(xiàn)有外泌體檢測(cè)方法對(duì)比，SERS的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、省時(shí)，是一種分析和檢測(cè)腫瘤外泌體的有效方法。2017年，該課題組又提出了一種同時(shí)多重檢測(cè)外泌體的方法［37］。為了識(shí)別三種不同癌細(xì)胞分泌的外泌體，在金納米粒子表面修飾三種對(duì)應(yīng)的適配體及拉曼報(bào)道分子制備成捕獲探針。上清液中存在有三種探針，當(dāng)一種目標(biāo)外泌體被加入，就會(huì)與相應(yīng)的磁珠和探針特異性吸附，復(fù)合物在磁鐵作用下被聚集到管子底部。這時(shí)，上清液中這種外泌體的捕獲探針明顯減少，對(duì)應(yīng)的這種探針的拉曼峰明顯減弱。為了驗(yàn)證該方法的實(shí)用性，試驗(yàn)最后采用從乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的患者體內(nèi)獲得的真實(shí)血液樣品進(jìn)行檢測(cè)。2018年，Tian等［38］再次證明“拉曼探針-外泌體-磁珠”結(jié)構(gòu)類型的SERS生物傳感器具有相當(dāng)大的潛力，可以作為便捷和高靈敏度的量化工具，以檢測(cè)生物樣品中的外泌體。2019年，Zhan等［39］基于帶負(fù)電的DNA四面體和帶正電的Au NPs之間靜電吸引的原理，開發(fā)出一種將金納米粒子組裝在四面體上的新型拉曼探針（assembling gold nanoparticles in triangular pyramid DNA，TP-Au NPs）。這種帶有強(qiáng)電磁熱點(diǎn)的傳感器可極大增強(qiáng)SERS信號(hào)。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7外泌體上的上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）含量很高，因此在檢測(cè)外泌體時(shí)，可選擇EpCAM適配體和膽固醇修飾的DNA用于識(shí)別和富集外泌體。首先，鏈霉親和素修飾的磁珠與生物素修飾的EpCAM適配體反應(yīng)，捕獲富集外泌體。其次，膽固醇修飾的DNA與TP-Au NPs SERS探針雜交，并且SERS探針上附著的膽固醇與外泌體脂質(zhì)膜之間的疏水相互作用進(jìn)而識(shí)別外泌體，形成類似“三明治”結(jié)構(gòu)。該方法可以有效區(qū)分從健康個(gè)體和乳腺癌患者血漿中提取的外泌體。循環(huán)外泌體PD-L1可作為預(yù)測(cè)抗PD-1/PD-L1的臨床療效指標(biāo)。2020年，Pang等［40］提出了一種可以直接從血清中捕獲和分析PD-L1外泌體的方法。首先，由于TiO2殼能與外泌體上磷脂分子的親水性磷酸“頭部”結(jié)合，因此可以利用Fe3O4@TiO2納米顆粒來富集外泌體。其次，加入PD-L1抗體修飾的Au@Ag@MBA-SERS標(biāo)記探針，對(duì)PD-L1外泌體進(jìn)行定量標(biāo)記。根據(jù)該方法，僅需使用4μL臨床血清樣品即可精確定量外泌體PD-L1，整個(gè)過程可在40 min內(nèi)完成。

鑒于miRNA在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中起到至關(guān)重要的作用，miRNA已被視為癌癥檢測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。外泌體脂質(zhì)雙層的性質(zhì)可以避免miRNA降解，使得外泌體中的特異性miRNA非常適合作為癌癥早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。一般標(biāo)記SERS技術(shù)檢測(cè)外泌體核酸的模型類似“三明治”結(jié)構(gòu)，miRNA鏈連接在探針與磁珠間，但是由于此時(shí)磁珠體積明顯比探針大，磁珠外表面均可以連接核酸與探針，因此形成了核衛(wèi)星結(jié)構(gòu)。2018年，Ma等［41］發(fā)展了一種基于雙鏈特異性核酸酶輔助循環(huán)放大的SERS方法，用于定量檢測(cè)人血液中外泌體的miRNA。2019年，Pang等［42］再一次驗(yàn)證了雙鏈特異性核酸酶輔助循環(huán)放大的SERS生物傳感器的可行性。該試驗(yàn)方法在核酸酶輔助下進(jìn)一步放大信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)單堿基識(shí)別的檢測(cè)限，并且不需要多次洗滌和雜交，適合于臨床診斷。

2.2 “拉曼探針-外泌體-芯片”SERS檢測(cè)模型

標(biāo)記SERS在外泌體的定性與定量研究中極具潛力。試驗(yàn)中，外泌體的分離與富集方法除了考慮如上述一樣使用磁珠之外，還可以考慮使用SERS芯片。利用外泌體上的兩種不同的蛋白質(zhì)，然后在基板和探針上分別修飾兩種特異性抗體，在靶向外泌體的存在下，可以在探針、外泌體和芯片之間形成類似“三明治”型免疫復(fù)合物，然后沖洗多余非靶向外泌體后即可進(jìn)行SERS檢測(cè)（圖3）。我們發(fā)現(xiàn)越來越多的“拉曼探針-外泌體-芯片”這類SERS檢測(cè)模型被提出并設(shè)計(jì)成相關(guān)試驗(yàn)。

2018年，Li等［43］開發(fā)了一種包被抗體的多巴胺芯片和SERS探針。該檢測(cè)芯片及拉曼探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)胰腺癌衍生外泌體的超靈敏和特異檢測(cè)，可在2 mL樣品溶液實(shí)現(xiàn)單個(gè)外泌體的檢測(cè)，并且只需通過2 mL的血清樣本的分析即可區(qū)分胰腺癌患者和健康人群。該方法有望用于胰腺癌的早期診斷、分類和轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)等方面。同年，Kwizera等［44］將一個(gè)模板陣列固定在標(biāo)準(zhǔn)鍍金玻璃鏡片上，然后在陣列孔板上修飾抗體制備成一種小型化親和基裝置用于外泌體的捕獲。金納米棒通過十六烷基三甲基溴化銨與外泌體上的脂質(zhì)膜之間的靜電作用與外泌體相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌患者來源的外泌體上幾種表面蛋白標(biāo)志物的定量檢測(cè)。HER2陽性乳腺癌患者血漿中的外泌體比健康供體中的HER2和EpCAM的水平更顯著（P≤0.01），表明HER2和EpCAM這些標(biāo)志物在乳腺癌診斷中的診斷潛力。該試驗(yàn)將加速外泌體的研究，并為新型癌癥液體活檢的實(shí)現(xiàn)奠定基石。由于外泌體miRNA表達(dá)水平與癌癥之間存在密切的關(guān)聯(lián)，因此Lee等［45］開發(fā)了基于SERS的傳感平臺(tái)，用于定量測(cè)定外泌體miRNA。首先在均勻的金納米柱基板上修飾捕獲探針，當(dāng)目標(biāo)外泌體miRNA出現(xiàn)時(shí)就會(huì)被探針序列捕獲，由于目標(biāo)外泌體miRNA序列較長(zhǎng)，還有部分序列裸露在外，因此再加入帶有拉曼報(bào)道分子的序列與裸露的序列進(jìn)行互補(bǔ)連接，即可在基底上同時(shí)鎖定目標(biāo)外泌體的miRNA及拉曼探針。該傳感器可以可靠地觀察乳腺癌細(xì)胞系中的外泌體miRNA表達(dá)模式，并可以基于這些模式之間的差異來區(qū)分乳腺癌亞型。結(jié)果表明，該傳感器可定量測(cè)量體液中外泌體miRNA，有望用于普遍的癌癥診斷和進(jìn)一步的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

外泌體廣泛存在于人體各種體液中，在細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)中扮演重要角色，是一種新興的液體活檢標(biāo)志物。然而當(dāng)前有關(guān)外泌體的研究尚處于初級(jí)階段，存在檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)步驟繁瑣、成本費(fèi)用高等問題。近年來，SERS技術(shù)被應(yīng)用于外泌體的檢測(cè)研究，極大地提高了外泌體檢測(cè)的靈敏度，這對(duì)于基于外泌體的液體活檢新技術(shù)的發(fā)展意義重大。SERS技術(shù)檢測(cè)外泌體的形式主要分為非標(biāo)記檢測(cè)與標(biāo)記檢測(cè)。非標(biāo)記檢測(cè)可獲得外泌體自身的整體生化信息，并且檢測(cè)簡(jiǎn)便、快捷、成本低；而標(biāo)記檢測(cè)則提高了對(duì)外泌體識(shí)別的特異性，還能夠同時(shí)識(shí)別并檢測(cè)多種癌細(xì)胞系分泌外泌體。雖然目前SERS技術(shù)在外泌體檢測(cè)方面已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但是深入研究依然面臨許多挑戰(zhàn)，例如：1）繼續(xù)探索高效的SERS檢測(cè)基底，進(jìn)一步提高外泌體的拉曼信號(hào)，提升檢測(cè)極限；2）繼續(xù)發(fā)展適用于外泌體表面蛋白和內(nèi)部核酸物質(zhì)的SERS檢測(cè)策略，獲得高質(zhì)量且重復(fù)性好的拉曼信號(hào)，提取全面的診斷信息；3）發(fā)展高效的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，對(duì)外泌體的SERS信號(hào)進(jìn)行深度挖掘，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來源外泌體的快速、準(zhǔn)確識(shí)別；4）對(duì)外泌體進(jìn)行功能化的改造，并結(jié)合SERS技術(shù)對(duì)外泌體的生物學(xué)行為進(jìn)行表征；5）繼續(xù)擴(kuò)大臨床檢測(cè)樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證基于SERS的外泌體檢測(cè)技術(shù)的可行性和適用性。隨著相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，我們相信基于SERS技術(shù)的外泌體檢測(cè)技術(shù)有望成為一種無損、便捷、準(zhǔn)確的液體活檢新方法。