方 杰，王 健，張啟云，李淼淼，肖睦滄，艾保全，熊建文

（華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院，廣州 510006）

白血病是一類造血系統(tǒng)的惡性腫瘤疾病。白血病細胞能在骨髓與其他造血組織中無限增殖，細胞凋亡受阻，從而抑制人體正常的造血功能，嚴重危害健康。目前治療方法主要有干細胞移植［1］、化療［2］、分子靶向治療［3］等，但是這些方法或多或少存在著問題。例如，胚胎干細胞移植會引起免疫排斥反應(yīng)，化療會影響正常細胞的生理功能。而光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種選擇性的、非侵入性的治療方法，可用于治療非腫瘤性疾病以及各種類型和部位的癌癥。良好的治療效果以及PDT與其他治療方案并行應(yīng)用的可能性使其在許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。光敏劑（photosensitizer，PS）作為反應(yīng)橋梁和能量載體顯著影響PDT效果，因而對光敏劑的研發(fā)、修飾成為目前研究的熱點問題。

二氧化鈦（TiO2）作為一種光催化劑，因化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低、光催化活性較高等優(yōu)點使其應(yīng)用于光動力治療中成為可能［4］。但其較寬的帶隙寬度和較高的電子-空穴復(fù)合率極大地限制了它的光催化效率。為了改善上述缺點，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)采取了許多策略，如貴金屬沉積［5］、半導(dǎo)體復(fù)合［6］、金屬和非金屬摻雜［7-8］、異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)［9］等。石墨化碳氮化物（g-C3N4）以其良好的化學(xué)穩(wěn)定性、適當?shù)膸逗鸵赘男缘碾娮咏Y(jié)構(gòu)在光催化領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。然而，g-C3N4也有一些缺點，如電荷分離不充分、電荷遷移率差，導(dǎo)致其光催化活性較低［10］。通過將銳鈦礦型TiO2與g-C3N4相結(jié)合，研究人員已經(jīng)制備出了一種比原始銳鈦礦型TiO2或g-C3N4對應(yīng)物具有更高光催化活性的復(fù)合材料［11-18］。然而，到目前為止，利用g-C3N4作為銳鈦礦型TiO2表面的殼層設(shè)計核-殼型異質(zhì)結(jié)光敏劑的研究還很有限。

本研究以四氯化鈦和尿素為前驅(qū)體，采用一步水熱還原法制備了含有一定氧空位和表面活性位點的納米碳改性的C-TiO2, 然后通過易操作的化學(xué)氣相沉積法構(gòu)建了g-C3N4表面修飾的g-C3N4@C-TiO2。通過探究C-TiO2與g-C3N4不同摻雜比例下構(gòu)建的g-C3N4@C-TiO2納米顆粒對HL60細胞的體外光動力滅活效果，驗證了g-C3N4@C-TiO2納米顆粒作為潛在光敏劑的可能性。

1 材料與方法

1.1 細胞株

由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供的人早幼粒白血病細胞（HL60細胞）。

1.2 試劑及儀器

無水乙醇（CH3CH2OH）、四氯化鈦（TiCl4）、乙二醇［（CH2OH）2］、氨水（NH3·H2O）、葡萄糖（C6H12O6）、尿素（CH4N2O）、甲醇（CH3OH）均購自于天津致遠化學(xué)試劑有限公司，臺盼藍試劑（美國Invitrogen），CCK-8試劑（日本Dojindo），RPMI-1640培養(yǎng)基（杭州四季青），活性氧檢測試劑（北京普利萊）。

磁力加熱攪拌器（江蘇科析），SK2510LHC超聲儀（上?？茖?dǎo)），WFY-28型熒光分光光度計（天津拓普），UV-2600紫外可見分光光度計（日本Shimadzu），場發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI），X射線粉末衍射儀（德國Bruker），PDT輻照室（自行設(shè)計），微量振蕩器（姜堰新康），酶標儀（美國Bio-Rad），CountessTM型自動細胞計數(shù)儀（美國Invitrogen），HH·CPTW二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒），SW-CJ型潔凈工作臺（蘇州安泰），細胞計數(shù)板，96孔板。

1.3 試驗方法

1.3.1 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的制備方法

C-TiO2的制備：取3 mL四氯化鈦溶于70 mL乙二醇中，得到A溶液；將A溶液置于冰水浴中，緩慢滴加2 mL氨水，邊攪拌邊滴加，常溫下磁力攪拌1 h，確保完全水解；隨后，逐滴加入0.01 g/mL的葡萄糖溶液5 mL，攪拌1 h，得到B溶液；將B溶液加入水熱合成反應(yīng)釜中，150℃水熱處理10 h，經(jīng)離心、洗滌后，將沉淀物在80℃下干燥12 h，最后將干燥的粉末以5℃/min的升溫速率加熱至450℃，煅燒3 h，得到初次結(jié)晶的C-TiO2。

g-C3N4@C-TiO2的制備：將尿素與蒸餾水按質(zhì)量比3∶4混合形成的尿素水溶液加入坩堝中，然后稱取0.3 g初次結(jié)晶的C-TiO2置于干凈玻璃片上，并使玻璃片恰好卡在坩堝內(nèi)2/3處，隨后放入馬弗爐中，以15℃/min的升溫速率升溫至400℃，煅燒1 h；再次以15℃/min的升溫速率升溫至500℃，煅燒2 h；取出玻璃片上的C-TiO2與坩堝底部的g-C3N4，按1∶1的質(zhì)量比放入50 mL甲醇中攪拌至無液相，然后120℃干燥12 h，得到m（g-C3N4）∶m（C-TiO2）為1∶1的納米顆粒g-C3N4@C-TiO2，標記為gCT-1。重復(fù)此試驗方法，制備m（g-C3N4）∶m（C-TiO2）分別為1∶2、2∶1的g-C3N4@C-TiO2納米顆粒，對應(yīng)標記為gCT-0.5、gCT-2。

1.3.2 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的表征方法

通過X射線衍射儀對樣品中由各種元素組成的具有確定結(jié)構(gòu)的化合物進行定性和半定量分析；熒光分光光度計對樣品的激發(fā)、發(fā)射光譜范圍及強度等進行分析；場發(fā)射透射電子顯微鏡對樣品進行成像分析，檢測樣品的尺寸、核-殼結(jié)構(gòu)及樣品的分散性；紫外-可見分光光度計對樣品的組成、含量和結(jié)構(gòu)進行測定；能譜儀對樣品所含元素的種類與含量進行分析。

1.3.3 HL60細胞的培養(yǎng)與計數(shù)

將HL60細胞接種于胎牛血清含量為10%的RPMI-1640培養(yǎng)基中，再把整個培養(yǎng)基置于5%CO2、37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后更換細胞培養(yǎng)液并將細胞均勻打散，用移液槍將此細胞液與臺盼藍按照1∶1的體積比混合，將混合液取至細胞計數(shù)板上，而后將細胞計數(shù)板插入CountessTM型自動細胞計數(shù)儀中進行計數(shù)，取處于對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

1.3.4 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒對HL60細胞的暗毒性試驗與PDT試驗

根據(jù)試驗?zāi)康模孪纫?guī)劃好96孔細胞培養(yǎng)板，試驗分為遮光板與光照板，每塊板分別設(shè)置對照組、試驗組和空白組。為了減少誤差，同一參數(shù)設(shè)置3個重復(fù)孔。取對數(shù)生長期的HL60細胞接種到96孔板中，對照組和試驗組中每孔均接種100μL細胞濃度為2×105個/mL的細胞液。接著在對照組中各加入100μL血清含量為10%的RPMI-1640培養(yǎng)液，試驗組中分別加入100μL終值質(zhì)量濃度為20、40、80、160、320 μg/mL的TiO2、C-TiO2、gCT-0.5、gCT-1及gCT-2溶液。將96孔板放到微量振蕩器中震蕩2 min，用無水乙醇擦拭消毒后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，將光照板置于PDT輻照室（波長為410 nm、光功率為5 mW/cm2）中光照1 h，接著繼續(xù)培養(yǎng)12 h；遮光板則避光處理連續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20μL CCK-8試劑［19］，混合均勻后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標儀測吸光度（optical density，OD）值。

利用公式（1）計算細胞的相對存活率：

式中：R為細胞的相對存活率；ODtreat為試驗組的吸光度值；ODblank為空白組的吸光度值；ODcontrol為對照組的吸光度值。

利用公式（2）計算PDT滅活效率：

式中：Pe為光動力滅活效率；ODirradiation為光照組的吸光度值；ODwithout-irradiation為遮光組的吸光度值。

1.3.5 細胞內(nèi)活性氧檢測

采用熒光探針標記技術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧水平［20］。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中（考慮到該試驗每孔需要接種的細胞液量大，特選用6孔板），每孔均接種3 mL細胞濃度為2×105個/mL的HL60細胞，分別加入終值質(zhì)量濃度為80μg/mL的藥物，在培養(yǎng)箱中共孵育12 h。將稀釋后的（用磷酸鹽緩沖液稀釋）濃度為 10μmol/L的DCFH-DA（2，7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）溶液加入6孔板中，振蕩混勻后放入培養(yǎng)箱中孵育30 min。取出細胞液，離心、棄上清，用磷酸鹽緩沖液清洗2次，隨后置于PDT輻照室中光照1 h，通過熒光分光光度計測量其熒光強度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

通過Origin 9.1和SPSS 24.0等軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，結(jié)果均用“均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的表征

2.1.1 X射線衍射圖譜分析

純 TiO2、C-TiO2、g-C3N4@C-TiO2樣品的 XRD圖譜如圖1所示。從圖1a中可以看出，TiO2、g-C3N4@C-TiO2納米顆粒在2θ= 25.28°、37.80°、48.05°、53.89°、55.06°、62.69°的位置處均出現(xiàn)了衍射峰，分別與銳鈦礦型TiO2的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）及（204）晶面相對應(yīng)，說明通過水熱還原法制得的納米顆粒主要為銳鈦礦型。碳與g-C3N4結(jié)合不改變TiO2的晶體結(jié)構(gòu)，樣品中未見明顯的碳峰，說明碳摻雜在銳鈦礦晶體中。圖1b是樣品在24°～28°衍射角的局部放大圖，C-TiO2樣品被遷移到一個較低的角度。這說明在銳鈦礦的間隙中摻雜了一些碳，導(dǎo)致間隙增大。此外，g-C3N4@C-TiO2納米復(fù)合材料的衍射角偏移到更大的角度，表明g-C3N4和C-TiO2相互作用所產(chǎn)生的應(yīng)力可能導(dǎo)致了TiO2晶格在熱沉積過程中的變形和收縮。

圖1 納米顆粒的X射線衍射譜Fig. 1 XRD patterns of different nanoparticles

2.1.2 熒光激發(fā)光譜及光源分析

g-C3N4@C-TiO2納米顆粒在波長為630 nm的激發(fā)光作用下測得的激發(fā)光譜如圖2a所示。圖2b是g-C3N4@C-TiO2納米顆粒在410 nm處的激發(fā)光譜局部放大圖。本實驗室PDT輻照室中所用的LED光源的發(fā)射光譜如圖2c所示，其發(fā)射峰位于408.64 nm處，與g-C3N4@C-TiO2的吸收譜有較好的重疊，能夠?qū)崿F(xiàn)可見光對該納米顆粒激發(fā)的試驗要求。

圖2 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的熒光激發(fā)光譜與PDT輻照室中LED光源的發(fā)射光譜Fig. 2 Fluorescence excitation spectra of g-C3N4@C-TiO2 nanoparticles and emission spectrum of LEDs in PDT irradiation chamber

2.1.3 透射電子顯微鏡成像分析

在教學(xué)實驗過程中，教師按計劃每學(xué)期安排4次考試，對不同教學(xué)模式下的實驗班、對照班學(xué)生的學(xué)習(xí)情況進行評價，并對實驗班、對照班歷次考試的數(shù)學(xué)成績進行對比分析。

圖3所示為g-C3N4@C-TiO2樣品的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）圖像?？梢杂^察到制備的g-C3N4@C-TiO2納米顆粒呈球狀或類方形，具有一定的分散性（圖3a、3b）。從高分辨透射電子顯微鏡（high resolution transmission electron microscope，HRTEM）圖像中可以看出（圖3c），薄的g-C3N4層緊緊包裹在C-TiO2納米顆粒周圍，說明g-C3N4在C-TiO2表面修飾成功，提高了光生載流子的透射率。此外，TiO2的晶格邊緣出現(xiàn)了明顯的缺陷（圖3c中的藍色圓圈表示），這主要是由于間隙碳摻雜引起的。在圖3d的HRTEM圖像中，TiO2晶格條紋排列整齊，其中晶格間距0.35 nm、0.23 nm分別對應(yīng)銳鈦礦型TiO2的（101）、（112）晶面。此外，納米顆粒的粒徑在10～20 nm之間，滿足納米顆粒進入細胞的尺寸條件（圖3e）。

圖3 不同納米顆粒的透射電鏡圖Fig. 3 TEM images of different nanoparticles

2.1.4 紫外-可見吸收光譜分析

圖4為納米顆粒的紫外-可見吸收光譜。發(fā)現(xiàn)TiO2的吸收譜主要位于387.5 nm以下，可能是由于其具有較寬的帶隙寬度（3.2 eV）。相較于TiO2的吸收光譜，C-TiO2和g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的吸收邊均不同程度地紅移至可見光區(qū)，其中g(shù)-C3N4@C-TiO2納米顆粒的吸收邊紅移更明顯。以上結(jié)果表明，復(fù)合納米顆粒的帶隙變窄對可見光的響應(yīng)有所改善。

2.1.5 能譜分析

g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的能譜（energy dispersive spectroscopy，EDS）分析結(jié)果如圖5所示，C、N、O、Ti元素峰表明g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的有效合成。此外，C、N、O、Ti的質(zhì)量分數(shù)分別為34.25%、1.44%、25.98%、38.33%，未發(fā)現(xiàn)其他雜質(zhì)元素。結(jié)果證明了在C-TiO2納米顆粒表面成功包裹了一層薄的g-C3N4。

圖4 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的紫外-可見吸收光譜Fig. 4 Ultraviolet-visible absorption spectrometry of g-C3N4@C-TiO2 nanoparticles

圖5 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒的EDS能譜Fig. 5 Energy dispersive spectroscopy of g-C3N4@C-TiO2 nanoparticles

2.2 細胞試驗

2.2.1 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒對HL60細胞的暗毒性試驗

圖6 暗室條件下不同摻雜比例g-C3N4@C-TiO2納米顆粒作用下的HL60細胞相對存活率（P＜0.05）Fig. 6 Relative viability of HL60 cells treated with different doping ratios of g-C3N4@C-TiO2 nanoparticles under darkroom conditions (P＜0.05)

2.2.2 g-C3N4@C-TiO2納米顆粒對HL60細胞的PDT體外滅活試驗

光照下質(zhì)量濃度為160μg/mL的不同藥物對HL60細胞的存活率和PDT滅活效率如圖7所示。由圖7a可知，與無光照組相比，光照組的細胞相對存活率下降更為明顯。顯然，TiO2和光照的組合降低了細胞的相對存活率。當同時用C-TiO2（或g-C3N4@C-TiO2）和光照處理細胞時，HL60細胞的相對存活率降低更為明顯，尤其是對于g-C3N4@C-TiO2納米顆粒，這說明了通過在C-TiO2表面包裹g-C3N4改善了可見光照射下的光動力滅活效率。根據(jù)圖7b可知，隨著納米顆粒質(zhì)量濃度的增加，PDT效率逐漸提高。當藥物的質(zhì)量濃度超過160μg/mL時，PDT效率的升高趨勢減慢。推測是因為納米顆粒的質(zhì)量濃度接近HL60細胞所能攝取的極限值。另外，當摻雜比為2:1時，g-C3N4@C-TiO2的PDT效率高于其他比例的納米顆粒，達到（76.5±1.9）%。

2.2.3 活性氧水平分析

在光動力治療中，當光敏劑受到特定波長的光激發(fā)時，其吸收的能量傳遞到周圍區(qū)域的氧分子產(chǎn)生單線態(tài)氧，或者通過電子轉(zhuǎn)移與其他底物發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生自由基。這些活性氧類物質(zhì)介導(dǎo)細胞毒性，從而導(dǎo)致細胞凋亡或壞死［21-23］。相關(guān)研究表明，使羅丹明、苯酚降解的是光催化過程中產(chǎn)生的·OH、·O2-等活性氧物質(zhì)［24］?；诖耍覀兛梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論：光動力治療過程中使HL60細胞滅活的是活性氧，而不是其他物質(zhì)的輔助作用。

圖7 光照條件下不同摻雜比例g-C3N4@C-TiO2納米顆粒作用下的HL60細胞相對存活率及PDT效率（P＜0.05）Fig. 7 Relative viability and PDT efficiency of HL60 cells treated with different doping ratios of g-C3N4@C-TiO2 nanoparticles under light irradiation (P＜0.05)

該試驗分析了光照后不同細胞組間活性氧的變化水平。結(jié)果如圖8所示，與TiO2、C-TiO2作用的細胞組相比，gCT-0.5、gCT-1及gCT-2納米顆粒作用細胞組的活性氧水平均有不同程度的提高，其中g(shù)CT-2的活性氧水平最高。這可能是由于TiO2容易團聚造成光照過程中照射到TiO2的面積有限，因而產(chǎn)生的活性氧含量較少。此外，TiO2的電子-空穴復(fù)合率高，參與氧化還原反應(yīng)的光生電子和光生空穴數(shù)量少，導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧含量低。然而C摻雜后形成的C-TiO2納米顆粒的帶隙寬度變窄，進一步通過g-C3N4包裹后其光催化活性和生物相容性均得到改善，同時有效降低了電子-空穴復(fù)合率，從而促進了光催化過程中的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生的活性氧含量高。這種變化與光照前后各組中細胞活性變化的趨勢一致，表明光照后gCT-0.5、gCT-1及gCT-2產(chǎn)生的活性氧是其在PDT過程中滅活細胞的主要原因。

以上試驗結(jié)果表明，g-C3N4的存在可以顯著提高TiO2在PDT過程中活性氧的產(chǎn)量。同時，g-C3N4的含量也會影響其活性氧產(chǎn)生的水平。g-C3N4@C-TiO2受到特定波長的光激發(fā)時，能產(chǎn)生更多的活性氧，誘導(dǎo)細胞凋亡或壞死，從而顯著提高對HL60細胞的光動力滅活效率。

圖8 光照條件下不同摻雜比例g-C3N4@C-TiO2納米顆粒作用下的HL60細胞內(nèi)活性氧含量Fig. 8 Relative viability and PDT efficiency of HL60 cells treated with different doping ratios of g-C3N4@C-TiO2 nanoparticles under light irradiation

3 討論

研究表明，對TiO2進行修飾可以顯著提高TiO2光動力滅活癌細胞的效率，因為修飾后的TiO2可以降低電子-空穴復(fù)合率［25-27］。當g-C3N4@C-TiO2吸收的光能高于電子跨越帶隙所需的能量值時，在g-C3N4和C-TiO2的表面會產(chǎn)生光生電子和空穴。一方面，與g-C3N4相比，由于C-TiO2價帶上的h+氧化能力強，因此可以更好地形成·OH。從這個角度來看，空穴不能從C-TiO2的價帶遷移到g-C3N4的價帶，并以較高的氧化電位保留在其原始位置，故而產(chǎn)生·OH。另一方面，當g-C3N4與C-TiO2結(jié)合時，g-C3N4表面的費米能級比C-TiO2高，從而產(chǎn)生了從g-C3N4到C-TiO2的內(nèi)在電場，阻止了C-TiO2價帶上的h+向g-C3N4價帶的移動。而由于固有電場的吸引，C-TiO2導(dǎo)帶上的電子易遷移到g-C3N4的價帶上，從而形成直接的Z型異質(zhì)結(jié)［24］。同時，填充在TiO2和g-C3N4之間的高導(dǎo)電性碳能夠快速誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移到g-C3N4的價帶上，因此其在形成直接Z型光催化異質(zhì)結(jié)中也起著重要作用。這顯著提高了g-C3N4@C-TiO2納米復(fù)合材料中光生電子和空穴的分離和轉(zhuǎn)移效率。因此，將有更多的光生空穴與附著在C-TiO2上的水反應(yīng)生成·OH，并且有更多的光生電子與溶解在水中的氧發(fā)生反應(yīng)而生成活性氧。這些自由基和活性氧具有很高的氧化性質(zhì)，可以氧化腫瘤細胞膜內(nèi)外的生物大分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等），破壞其正常的生理和代謝功能，最終導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡或壞死［28-30］。

本文通過水熱還原法制備了納米碳改性的C-TiO2, 后采用化學(xué)氣相沉積法構(gòu)建了核-殼結(jié)構(gòu)的g-C3N4@C-TiO2納米顆粒，通過X射線衍射、熒光光譜、透射電子顯微鏡和紫外-可見吸收光譜對納米顆粒的結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)進行了探究。g-C3N4在C-TiO2表面包裹后，其通過π-共軛及氫鍵與C-TiO2緊密結(jié)合。與純TiO2相比，碳摻雜后導(dǎo)致TiO2的帶隙變窄，吸收邊紅移，從而使TiO2可吸收的光波長范圍拓展至可見光波段［31］。同時，制備的g-C3N4@C-TiO2粒徑在10～20 nm，小于100 nm，能滿足納米顆粒進入細胞的尺寸要求［32］。暗毒性試驗證明了g-C3N4@C-TiO2具有較好的生物相容性。此外，隨著納米顆粒質(zhì)量濃度的升高，其對HL60細胞的PDT滅活效率也隨之提高。當質(zhì)量濃度為320μg/mL時，gCT-2對HL60細胞的PDT滅活效率為（76.5±1.9）%，而此時TiO2的PDT滅活效率為（26.7±2.7）%。由此可見，在相同條件下，g-C3N4@C-TiO2納米復(fù)合材料對HL60細胞的光殺傷效率遠高于TiO2納米顆粒，進一步說明了g-C3N4量子點的引入可以顯著提高TiO2的光催化滅活效果。

綜合以上分析，制備的g-C3N4@C-TiO2納米顆粒有良好的生物相容性和PDT滅活效果，具備作為潛在光敏劑治療白血病的可能性，但其在體內(nèi)PDT滅活效果還未被探究。因此，g-C3N4@C-TiO2納米顆粒對活體內(nèi)的HL60細胞是否具有殺傷效果以及對正常細胞是否有影響，將是我們下一步工作的重點。