陳雯雯, 甘忠橋, 秦建華*

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

外泌體是一類由細(xì)胞分泌的含有脂質(zhì)、蛋白、核酸等多種物質(zhì)的納米級囊泡,其尺寸為30～150 nm[1-3](見圖1)。外泌體在人體中分布廣泛,人體的外周血、尿液、乳汁、羊水等體液中均含有外泌體[4,5]。因外泌體可攜帶蛋白、運送RNA,其在人體中的角色主要包括物質(zhì)的傳遞以及信息的傳導(dǎo)兩個大方面[6,7]。據(jù)此,人們將外泌體分為兩種類型,第一種為有免疫活性的外泌體,其主要在抗原呈遞和共刺激中發(fā)揮作用,第二種則是含有數(shù)量可觀的RNA并可介導(dǎo)細(xì)胞間的遺傳物質(zhì)交流的外泌體[8,9]。外泌體與細(xì)胞的作用方式主要包括通過受體與靶細(xì)胞相互作用,激活下游細(xì)胞內(nèi)的信號,以及直接與細(xì)胞膜融合從而將外泌體的膜蛋白整合到細(xì)胞漿膜或者是通過內(nèi)吞作用將其轉(zhuǎn)運分子傳遞至靶細(xì)胞的胞漿內(nèi)。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)外泌體在適應(yīng)性免疫[10,11]、炎癥過程、胚胎形成[12]、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程[13,14]中均發(fā)揮了重要的作用。以腫瘤為例,外泌體可以通過調(diào)節(jié)免疫功能,促進腫瘤血管新生以及腫瘤轉(zhuǎn)移,或者直接作用于腫瘤細(xì)胞影響腫瘤進展[15-18],因而外泌體獲得了越來越多科學(xué)工作者的關(guān)注[19]。

圖1 外泌體形成及組成示意圖[1]Fig. 1 Biogenesis and secretion of exosomes[1]

外泌體尺寸較小且其密度和體液接近,想要精準(zhǔn)地對外泌體進行分離與檢測十分困難。在過去的十幾年中,微流控芯片技術(shù)因其具有微型化、高通量、可集成及低消耗等特點,為外泌體的精準(zhǔn)分離分析提供了一種潛在平臺。本文主要介紹了微流控芯片技術(shù)在外泌體分離分析相關(guān)研究領(lǐng)域的進展,并對其發(fā)展前景予以展望。

1 現(xiàn)有的外泌體分離方法

外泌體的高效分離與富集是對其研究的前提條件,目前較為常用的外泌體分離方法主要有超速離心、超濾、免疫親和捕獲、聚合物共沉淀以及基于微流控技術(shù)的外泌體分離方法等5種(見表1)。

表1 不同外泌體分離方法的比較

1.1 超速離心法

超速離心[20]分離外泌體是通過離心力作用使不同密度、大小的物質(zhì)分離開來。主要可以分為兩類:一類為差速離心,一類為密度梯度離心。

差速離心即通過改變離心的速度,從而改變離心力的大小,使不同密度的物質(zhì)分級分離。在分離外泌體時,便是通過不斷提高離心機的轉(zhuǎn)速,先將細(xì)胞及細(xì)胞碎片分離出來,最后再將尺寸較小的外泌體分離出來。

而密度梯度離心則是使用一種密度能形成梯度(在離心管中其密度從上到下連續(xù)增高)又不會使所分離的物質(zhì)凝聚或失活的溶劑系統(tǒng)對樣本進行分離的方法。離心后各物質(zhì)顆粒能夠按其各自的比重平衡在相應(yīng)的統(tǒng)計密度中形成區(qū)帶,較為常用的密度梯度溶劑是蔗糖。實驗結(jié)果表明,當(dāng)采用蔗糖為梯度溶劑時,樣品中的外泌體將在1.13～1.19 g/mL的密度范圍內(nèi)富集[21]。采用超速離心法通常較為耗時,且對設(shè)備依賴程度較高,以離心力為驅(qū)動力還有可能對囊泡造成損害,導(dǎo)致外泌體的破碎與損失。

1.2 超濾法

超濾[22]即在一定的壓力作用下,使待分離液體通過具有一定孔徑的特制薄膜,尺寸小于薄膜孔徑的物質(zhì)將通過薄膜,而尺寸大于薄膜孔徑的物質(zhì)將被截留在薄膜上。外泌體的尺寸一般為40～100 nm,因而可以通過利用不同截留尺寸的超濾膜將外泌體從樣品中分離出來。使用超濾法分離外泌體操作簡單,但是超濾所使用的壓力可能會導(dǎo)致囊泡的形變和破裂,且膜孔易堵塞,使用該分離方法最終結(jié)果可能導(dǎo)致蛋白污染較多。

1.3 免疫親和捕獲法

基于免疫親和捕獲分離外泌體,主要依據(jù)是外泌體表面含有其特異性標(biāo)記物,如CD9、CD63等。在平面或磁珠上包被抗標(biāo)記物的抗體,當(dāng)外泌體經(jīng)過此平面或磁珠時,便可以與抗體結(jié)合從而分離出來[23,24]。此外,不同細(xì)胞分泌的外泌體其表面含有的抗原存在差異,可通過選擇不同的抗體實現(xiàn)對不同的外泌體的提取與分離[25]。使用免疫親和捕獲法來捕獲外泌體,特異性高、操作簡便且不影響外泌體形態(tài)的完整性,但是效率較低,抗體價格昂貴,存在活性和批次差異。

1.4 聚合物共沉淀法

共沉淀法分離外泌體是通過在待分離樣品中加入其他溶劑,改變樣品中物質(zhì)的溶解度及分散特性,從而將外泌體從溶液中分離出來。目前報道的最常用的共沉淀劑是聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)[26], PEG可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀,早期人們[27]將其應(yīng)用于從血清等樣品中提取病毒,現(xiàn)在也被用來提取外泌體,加入PEG后先將沉淀出的蛋白等物質(zhì)分離出來,然后靜置,利用各物質(zhì)沉淀速率不同將其分離。使用PEG沉淀法操作簡單,但純度和回收率較低,且聚合物的除去較為困難,因此想要廣泛應(yīng)用仍需要不斷改進技術(shù)條件。

2 基于微流控技術(shù)的外泌體分離方法

目前基于微流控技術(shù)的外泌體分離方法主要分為兩大類。一類是基于外泌體物理性質(zhì)如尺寸等的分離方法,另一類為基于外泌體生化特性如表面蛋白表達(dá)等的分離方法[28]。

2.1 基于外泌體物理特性的分離方法

針對外泌體物理特性進行分離的研究主要集中在尺寸差異上,外泌體的尺寸為30～150 nm,而細(xì)胞的尺寸一般在微米數(shù)量級,其他的細(xì)胞外囊泡如微囊泡以及凋亡小體的大小也和外泌體存在差異,因而可以利用它們尺寸的差異將外泌體從混合物中分離出來。和其他的分離方法相比,使用基于尺寸的方式分離出的外泌體大小更加均一。在微流控芯片中,基于外泌體尺寸進行分離主要有兩大類。一類為使用納米孔膜、納米陣列、微過濾器等器件結(jié)構(gòu)直接對樣品進行過濾,將外泌體從中分離出來。另一類使用流場技術(shù),通過施加動力作用或場作用使外泌體和其他物質(zhì)分離開。此外,也可以將這兩種方式結(jié)合進行外泌體的分離,在接下來的文章當(dāng)中將對這兩類分離方式進行詳細(xì)介紹。

2.1.1納米孔膜、納米陣列過濾

在最近的研究中,有學(xué)者[29]報道了一種使用雙層膜過濾分離尿液中外泌體的體系(見圖2a):該微流控芯片的核心部分是兩個濾膜,作者將經(jīng)過離心前處理的樣品加入芯片中,樣品先流經(jīng)孔徑為200 nm的濾膜,去除樣品中體積較大的物質(zhì)如細(xì)胞碎片和一些較大的囊泡等;之后樣品又流經(jīng)一個孔徑為30 nm的濾膜,此時樣品中尺寸小于200 nm大于30 nm的物質(zhì)都將被截流下來。后期可以直接在此芯片中對截流下的外泌體進行染色等操作。相較于傳統(tǒng)的超速離心方式,雙層膜過濾耗時短,設(shè)備簡單。該裝置的外泌體捕獲率為81.3%,特異性為90%。Woo等[30]也利用了雙層膜過濾的方式對外泌體進行分離(見圖2b),他們將驅(qū)動力改成了離心力,裝置可以實現(xiàn)對血液中尺寸為20～600 nm的囊泡的富集,分離效率大于95%。此外,也有學(xué)者[31]利用膜過濾的方式,研究出了外泌體分級分離的芯片(exosome total isolation chip, ExoTIC);該芯片的構(gòu)造和過濾器類似,通過改變中間夾膜的孔徑,實現(xiàn)對不同尺寸物質(zhì)的截留。而將具有不同濾膜孔徑的芯片串聯(lián)起來,便可以實現(xiàn)對外泌體的分級分離;分離后將濾器中間的濾膜取出,并將其上截留的外泌體溶解到溶劑中去,實現(xiàn)對不同尺寸外泌體的分離與富集。

圖2 基于納米孔膜、納米陣列過濾分離外泌體的微流控方法Fig. 2 Exosome separation microfluidic chips based on nano-filters and nano-arrays a. isolation and detection of EVs from urine using an integrated double-filtration microfluidic device[29]; b. exodisc for rapid, size-selective, and efficient isolation and analysis of nanoscale extracellular vesicles from biological samples[30].

確定性側(cè)向位移(deterministic lateral displacement, DLD)柱形微流控芯片是一種可以有效分離和富集微米級顆粒包括血液中的寄生蟲、細(xì)菌、血細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞等物質(zhì)的技術(shù)。來自IBM、普林斯頓大學(xué)與西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們合作設(shè)計并制造出了納米級DLD(nano-DLD)芯片[32],該芯片具有25～235 nm范圍的均勻的間隙尺寸;經(jīng)過實驗他們發(fā)現(xiàn),在低佩克萊數(shù)情況下,擴散和確定性位移產(chǎn)生競爭時,nano-DLD芯片仍然可以靈敏地將20～110 nm的顆粒分開。

無獨有偶,來自美國納米醫(yī)學(xué)中心的研究者同樣利用柱型微流控芯片實現(xiàn)了對外泌體的分離[33]。與前者不同的是,他們通過在形成的陣列微米柱上構(gòu)建多孔硅的纖毛從而實現(xiàn)對外泌體的捕獲與富集;通過控制合成條件,可以獲得不同的纖毛形態(tài)及密度。當(dāng)細(xì)胞、細(xì)胞碎片、外泌體以及蛋白等流經(jīng)該帶纖毛的微米柱陣列時,細(xì)胞以及細(xì)胞碎片因為體積過大,不能夠被纖毛捕獲,外泌體則可以被纖毛捕獲,而蛋白等生物小分子因體積過小,會從纖毛的間隙溜走,因而此帶有多孔硅納米線的微柱陣列可以實現(xiàn)對外泌體的分離與富集。在實現(xiàn)捕獲后可以通過加入磷酸鹽緩沖液將多孔的納米線結(jié)構(gòu)溶解掉,從而將捕獲到的外泌體完整地釋放出來。

2.1.2物理場分選

除了使用器件對樣品進行直接過濾,人們也在微流控芯片上使用流場技術(shù)對外泌體進行分離[34]:杜克大學(xué)的學(xué)者利用聲學(xué)技術(shù)和微流控芯片技術(shù)相結(jié)合(以下簡稱聲波微流控),設(shè)計了一種可以不用標(biāo)記及直接接觸便可以實現(xiàn)外泌體分離和富集的方法。該聲波微流控平臺包含細(xì)胞去除以及外泌體分離兩個模塊。當(dāng)施加一定頻率的聲波時,流體中的微粒將會受到聲波輻射力的作用,其大小和粒子的體積成正比。而當(dāng)微粒受到聲波輻射力影響要發(fā)生位置的偏移時,又會受到一個斯托克斯拽力的作用,其大小與粒子的半徑成正比。當(dāng)粒子的體積增大10倍時,斯托克斯拽力增大10倍,而聲波輻射力增大1 000倍,因而體積越大的微粒,受聲波場的影響就越明顯,運動軌道偏移越大,利用此原理便可以將不同尺寸大小的粒子分離開來。使用該平臺所獲得的外泌體血液細(xì)胞的去除率達(dá)到99.999%。

將電場和磁場結(jié)合到微流控芯片上進行外泌體的分離近來也有報道。Cho等[35]提出了利用電場遷移來分離外泌體的方法。該方法在孔徑為30 nm的滲透膜施加穿透膜的電場,在電場的作用下蛋白等發(fā)生遷移從而透過膜到外側(cè),而外泌體則會被截留在滲透膜上從而實現(xiàn)分離與富集。該方法分離效率較高,在尺寸上可以達(dá)到和超速離心類似的分離結(jié)果。和傳統(tǒng)的超速離心方法相比,該種分離方式在RNA水平上的回收率為65%,比超速離心高了7.9倍,蛋白的去除效率在30 min內(nèi)可以達(dá)到83.6%。

此外,也有學(xué)者[36]提出了一種利用黏彈流對外泌體進行分離的方法(見圖3),該方法通過在樣品中加入一種具有生物相容性的聚合物來控制作用在外泌體上的黏彈力從而實現(xiàn)對外泌體的分離,通過選擇合適的濃度峰參數(shù),最終所分離出的外泌體的純度可大于90%,回收率大于80%。

圖3 基于物理場分選分離外泌體的微流控方法Fig. 3 Exosome separation microfluidic chips based on physical field Field-free isolation of exosomes from extracellular vesicles by microfluidic viscoelastic flows[36].

2.2 基于外泌體生化特性的分離方法

目前針對外泌體生化特性進行分離的研究主要集中在表面蛋白表達(dá)的差異上,通常通過免疫捕獲的方式將外泌體從樣本中分離出來。免疫捕獲即將和外泌體相關(guān)的抗體吸附在固相載體表面,從而對外泌體進行捕獲的技術(shù)。該技術(shù)具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點,因而被廣泛使用。在微流控系統(tǒng)中采用免疫捕獲的方式分離外泌體,從基底的狀態(tài)上分可以分為固定基底免疫捕獲和非固定基底免疫捕獲兩種。

2.2.1固定基底免疫捕獲

顧名思義,固定基底免疫捕獲就是將捕獲所需的抗體修飾在平面或有結(jié)構(gòu)的基底上,但基底本身不可移動。較常用來作為標(biāo)記物的蛋白是外泌體特異性的CD9、CD63以及CD81,此外針對一些具有自己特異性蛋白的外泌體,也可以用相應(yīng)的蛋白抗體來進行捕獲,如EpCAM[37]等蛋白。有學(xué)者[38]設(shè)計并制造了一種可以實時對外泌體進行定量分析的技術(shù),該技術(shù)通過在平面底部修飾上外泌體特異性蛋白的抗體,實現(xiàn)對外泌體的捕獲,接著通過表面等離子體成像(surface plasmon resonance imaging, SPRi)對信號進行分析。此外,將具有納米結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯和聚多巴胺修飾在平面上,再修飾上捕獲外泌體的抗體可以顯著提高外泌體的捕獲效率[39](見圖4a)。

圖4 基于固定基底免疫捕獲分離外泌體的微流控方法Fig. 4 Exosome separation chip based on immune capture on fixed base a. nano-interfaced microfluidic exosome platform (nano-IMEX)[39]; b. schematic illustration of the exosome capture and release using an exosome-specific dual-patterned immuno filtration (ExoDIF) device[40].

Kang等[40]則提出了一種可以實現(xiàn)外泌體可逆捕獲和釋放的裝置(見圖4b)。該裝置由兩個不同的被免疫標(biāo)記的具有結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷層組成,圖案的設(shè)計結(jié)合機械旋轉(zhuǎn)可以有效地提高抗體與外泌體結(jié)合的概率,從而可以在獲得高的特異性的同時也獲得高的外泌體的通量。作者在修飾過程中使用了具有雙硫鍵的DTSSP(3,3′-二硫代雙(磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯))這一物質(zhì),在捕獲完成后,加入具有還原性的DTT(二硫蘇糖醇)便可以成功地使雙硫鍵斷裂開,從而使所捕獲到的外泌體被釋放出來,以便于下游的進一步分析。

此外,人們也將一些微結(jié)構(gòu)應(yīng)用到了對外泌體的捕獲上,如魚骨結(jié)構(gòu)[41,42]、三角結(jié)構(gòu)等,這些微納結(jié)構(gòu)的加入,不僅可以增大捕獲底面的比表面積,還可以增加液體的混合,提高捕獲效率。Chen等[43]構(gòu)建了一種納米氧化鋅包覆的三維支架芯片,三維支架相互連接的微孔使流體流動呈現(xiàn)混流或漩渦特征,氧化鋅納米線陣列為外泌體特異性抗體的固定提供了較大的表面積,納米陣列具有尺寸排斥效應(yīng),對體積較大的囊泡有較好的去除作用。

2.2.2非固定基底免疫捕獲

和固定基底免疫捕獲相對應(yīng),非固定基底免疫捕獲即將捕獲抗體修飾在可移動的基底上,微珠是目前較為常用的非固定外泌體捕獲基底。外泌體的尺寸只有30～150 nm,直接分離的話較為困難,設(shè)備依賴性強。通過在微珠等表面修飾外泌體特異性的抗體等,便可以對外泌體進行捕獲與富集。之后只要對捕獲了外泌體的微珠進行操作便可以將外泌體分離出來,化小為大,操作將更為便捷。目前使用較多的微珠是磁珠和硅珠。Godwin等[44]將免疫捕獲分離和外泌體的目標(biāo)蛋白檢測集合在微流控芯片上,開發(fā)了一種新的可以對外泌體蛋白直接進行分析檢測的技術(shù)。該微流控芯片主要由兩部分組成,第一部分為外泌體捕獲單元,即加入修飾了抗體的磁珠,可以對外泌體進行捕獲。第二部分為蛋白檢測單元,加入蛋白提取劑,便可以在這個芯片上實現(xiàn)對外泌體蛋白的自動化檢測。該實驗裝置可在100 min內(nèi)實現(xiàn)對30 μL血液樣品的檢測。無獨有偶,直接在芯片上實現(xiàn)對外泌體中的miRNA(micro-ribonucleic acid)檢測的芯片也已有報道[45],檢測芯片由外泌體捕獲、RNA捕獲、反轉(zhuǎn)錄以及qPCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)4個功能單元組成,外泌體在第一個腔室被表面標(biāo)記有抗體的磁珠捕獲后,加入RNA裂解液,裂解出的RNA進入到第二個腔室被捕獲,之后洗脫出來,進入第三個腔室進行反轉(zhuǎn)錄,最后在第四個腔室進行qPCR,便可以對捕獲的外泌體的RNA進行鑒定。此外,要對一種特定疾病的外泌體進行判定,有時需要同時對多個蛋白進行檢測,這一點,也已經(jīng)有學(xué)者利用免疫標(biāo)記的磁珠實現(xiàn)[46]:研究人員以卵巢癌分泌的外泌體為例,用CD9的抗體來進行捕獲,對CA-125、EpCAM、CD24這3種蛋白進行了免疫熒光標(biāo)記,并對其光強等進行了檢測,實驗結(jié)果表明該方式可以實現(xiàn)對外泌體的多種標(biāo)志蛋白的檢測。

而使用不帶磁性的微珠進行捕獲,通常是在捕獲之后利用濾膜截流以及通過流場的作用將吸附了外泌體的微珠分離出來。Dudani等[47]提出了一種可以將外泌體分離與外泌體熒光檢測同步進行的技術(shù)(見圖5a):作者使用了表面標(biāo)記有CD63抗體的微球,將其和含有外泌體的樣品以及表面標(biāo)記有藻紅蛋白的anti-CD81一起培養(yǎng),之后再將微球和緩沖鹽溶液一起從不同的入口注入微流控芯片中,在流體慣性力的作用下,微珠將遷移到緩沖液中,從而被分離出來;在微珠收集口處有個熒光檢測器,可以實現(xiàn)對外泌體熒光的檢測。

圖5 基于非固定基底免疫捕獲分離外泌體的微流控方法Fig. 5 Exosome separation chip based on immune capture on unfixed base a. exosome isolation and detection using rapid inertial solution exchange[47]; b. exosome separation chip based on magnetic nanoparticles[48].

除了使用相對外泌體而言體積較大的微珠,比外泌體尺寸小很多的磁性納米顆粒[48]也被應(yīng)用于對外泌體的分離中(見圖5b)。通過在磁性納米顆粒表面修飾上相應(yīng)的抗體,可以使其和外泌體特異性結(jié)合而使外泌體帶有磁性,接著便可以通過對磁場的操控將外泌體從磁性納米孔(exosome track-etched magnetic nanopore, ExoTENPO)中分離出來[48]。

表2對上述提到的方法進行了歸納與總結(jié)。

表2 基于微流控技術(shù)的外泌體分離方法

3 現(xiàn)有的外泌體分析方法

外泌體的分析一般是指對其形貌、粒徑分布和攜帶的生化信息等參數(shù)的表征。圍繞這些方面,現(xiàn)有的外泌體分析方法主要有顯微鏡圖像觀測、光散射粒徑分析、可調(diào)電阻脈沖傳感、抗體檢測、流式細(xì)胞術(shù)等。

3.1 顯微鏡圖像觀測

外泌體的尺寸在100 nm左右,傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡因衍射極限的限制無法觀察到這類囊泡[49]。近幾十年,電子顯微鏡(掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡)和原子力顯微鏡在納米級別樣品表征中快速興起,逐漸成為外泌體研究的重要工具。

掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)利用電磁透鏡將電子束在樣品表面聚焦,通過高能電子束與樣品相互作用產(chǎn)生二次電子、反射電子、X射線等信號,獲得樣品表面信息,具有景深大、放大范圍廣、制樣簡單等諸多優(yōu)點,常用于外泌體形態(tài)和粒徑的表征[50]。相比于SEM,透射電子顯微鏡(transmission Electron Microscope, TEM)具有更高的分辨率(低于1 nm)[51,52],不足的是,由于TEM是在真空中進行的,生物材料需要固定和脫水,會影響外泌體的尺寸和形態(tài),煩瑣的樣品制備過程也使測量時間以小時為單位[53,54]。

原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)是一類通過分析樣品表面的原子與微懸臂探針尖端的原子間的相互作用力來研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的掃描探針顯微鏡,其分辨率可達(dá)亞納米級[55-57]。由于原子力顯微鏡極高的分辨率,外泌體必須結(jié)合在一個非常平坦的表面上,例如云母,而抗體可以用來將外泌體與表面結(jié)合,這樣也可以獲得生化信息。由于使用抗體與表面結(jié)合的微囊效率未知,因此微泡的濃度無法確定。此外,表面結(jié)合可能會影響微泡的形態(tài),這可能會阻礙真實直徑的測定[53]。

3.2 光散射粒徑分析

在外泌體的分析檢測中,光散射技術(shù)通常用于表征外泌體的尺寸分布。

小角X射線散射(small angle X-ray scattering, SAXS)是一項基于X射線光子在低角度下對樣品電子彈性散射的分析技術(shù),可在1～200 nm范圍提供樣品結(jié)構(gòu)信息[58,59]。值得注意的是,SAXS在對樣品粒徑進行表征時,需要單分散、高濃度的樣品[58]。

動態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)是一項測定膠體懸浮液粒徑的常用技術(shù)[60]。其原理在于將布朗運動與粒子的大小聯(lián)系起來,利用這種技術(shù)可以檢測直徑在1 nm到6 μm之間的粒徑分布[61],是外泌體粒徑表征的常用方法[62,63]。但其受水化層等界面因素的影響,測得的尺寸要比外泌體真實尺寸偏大[54]。

納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)是一種可以對外泌體的尺寸和濃度進行表征的技術(shù)。在NTA方法中,主要通過跟蹤單個外泌體隨時間的移動并計算每外泌體的均方位移,確定流體動力學(xué)半徑并顯示出外泌體的大小分布[64,65]。

3.3 可調(diào)電阻脈沖傳感

可調(diào)電阻脈沖傳感(tunable resistance pulse sensor, TRPS)是一項單粒子原位表征技術(shù)[66],該檢測系統(tǒng)主要由帶有兩個電極的流體腔室和一塊彈性絕緣聚氨酯膜組成,在聚氨酯膜中含有一個圓錐形狀的納米孔。通過監(jiān)測粒子通過納米孔時產(chǎn)生的脈沖信號,可以精確測量溶液中外泌體的濃度和粒徑分布。相比DLS, NTA等技術(shù),TRPS不依賴布朗運動,樣品用量少,測量速度快,可同時對外泌體的尺寸、濃度和zeta電位等重要參數(shù)進行測定[67,68]。

3.4 抗體檢測

抗體檢測主要依據(jù)抗體和抗原的相互作用,將外泌體表面的蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)化為熒光、吸光等可測量信號從而對外泌體進行分析。目前在外泌體蛋白檢測中最常用的是蛋白印跡法(western blot)該方法具有特異性強、易用性高等特點[69],可根據(jù)CD81、HSP70等蛋白的存在情況輔助外泌體的鑒定[70]。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)也是一種常用來對外泌體蛋白進行檢測的方法[71],相比于Western blot, ELISA在蛋白的定量分析中精度更高,但依賴于酶標(biāo)儀等設(shè)備,且不能得到蛋白相對分子質(zhì)量等信息。此外,以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)的比色分析法在外泌體蛋白的檢測中也有一定的應(yīng)用,該方法可以在幾分鐘內(nèi)對外泌體表面蛋白的細(xì)微差異進行表征[72]

3.5 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是一種集細(xì)胞高通量分選和多參數(shù)檢測于一體的精密技術(shù)[73],流式細(xì)胞儀在細(xì)胞研究中的成功運用使得其在外泌體檢測上也開始受到廣泛關(guān)注[74]。貝克曼等一些公司建立的納米流式細(xì)胞儀(nano-flow cytometer, nano-FCM)能夠檢測到尺寸小于100 nm的外泌體相關(guān)囊泡,隨著流式技術(shù)的改進和外泌體特異性標(biāo)記試劑的開發(fā),流式細(xì)胞術(shù)有望在該領(lǐng)域發(fā)揮舉足輕重的作用[56]。

接下來,在表3中對上述提到的外泌體常用檢測方法進行了歸納與總結(jié)。

表3 不同外泌體分析方法的比較

4 基于微流控技術(shù)的外泌體分析方法

隨著技術(shù)的進步,外泌體檢測的各種方法不斷涌現(xiàn),前面介紹的方法往往需要相對龐大和復(fù)雜的實驗室基礎(chǔ)設(shè)施。近年來,微流控技術(shù)高速發(fā)展,許多基于微流控技術(shù)的外泌體檢測方法不斷被報道,這些檢測方法具有分析速度快、靈敏度高、試劑消耗少、攜帶方便等優(yōu)點。此外,微流控技術(shù)易于模塊化并可多單元集成,這意味著可以將外泌體的純化、富集和檢測整合到微流控平臺上,為臨床發(fā)現(xiàn)外泌體生物標(biāo)志物和對腫瘤等疾病的診斷與預(yù)后提供巨大的潛力[75]。目前基于微流控的外泌體分析方法大致可以分為:熒光檢測、表面等離子體共振、核磁共振、數(shù)字液滴PCR、電化學(xué)傳感等,下面將對提到的這幾種方法進行詳細(xì)的介紹。

4.1 熒光檢測

熒光是一種物質(zhì)在吸收光照或者其他電磁輻射后出現(xiàn)冷發(fā)光的現(xiàn)象。其熒光強度、波長、發(fā)光時間與材料的性質(zhì)有關(guān)。因此,觀測熒光的發(fā)射參數(shù)可以用來檢測目標(biāo)樣品。熒光成像技術(shù)具有精度高、靈敏度高等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于微流控芯片的外泌體檢測系統(tǒng)中。近期的研究報道中,Ai等[50]建立了一種微流控水動力分析平臺,該平臺首先利用微珠對溶液中的外泌體進行初步的捕獲,然后利用微流控芯片將富集有外泌體的微珠進行分散與固定,在芯片上實現(xiàn)了外泌體的大規(guī)模多重?zé)晒夥治?見圖6a)。而Hansford等[76]則構(gòu)建了一種經(jīng)過抗體功能化的人字形溝槽微流控裝置,在實驗中,研究人員將其用于高級別漿液性卵巢癌病人血清中外泌體的分析,利用熒光顯微鏡對微流控芯片捕獲和釋放的外泌體進行表征,從而實現(xiàn)了外泌體的洗脫過程的動態(tài)監(jiān)測(見圖6b)。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和微流控技術(shù)相結(jié)合在外泌體檢測方面也有很大的潛力。一種基于微流控技術(shù)的多功能流式細(xì)胞儀成像檢測系統(tǒng)已被用于卵巢癌的早期檢測,該方法通過建立由平行納米通道組成的流式細(xì)胞術(shù)陣列,成功地實現(xiàn)了外泌體的計數(shù)[77]。從發(fā)展趨勢來看,基于微流控芯片的熒光檢測方法在外泌體檢測中的應(yīng)用將會越來越廣泛。

圖6 微流控芯片與熒光檢測聯(lián)用用于外泌體檢測Fig. 6 Detection of exosomes by microfluidic chip combined with fluorescence detection a. hydrodynamic fluorescence analysis of exosomes based on microfluidic control[50]; b. dynamic fluorescence detection of exosomes in the process of elution on microfluidic chip[76].

4.2 表面等離子體共振

表面等離子體共振(SPR)是一種無標(biāo)簽的實時跟蹤傳感技術(shù),通過分子吸附在金屬表面引起的折射率改變實現(xiàn)對生物分子的痕量分析。近年來,基于SPR技術(shù)的納米傳感器因其在分子檢測上的高靈敏性而備受關(guān)注。Hu等[78]開發(fā)了一種基于SPR的外泌體微流控芯片傳感器,實驗中該團隊將抗體修飾在金的表面,在利用抗體微陣列捕獲外泌體后,金表面的折射率發(fā)生改變,實現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中的外泌體的定量檢測,為外泌體的分離分析提供了一種簡便、高效的策略。

4.3 核磁共振

核磁共振現(xiàn)象(nuclear magnetic resonance, NMR)是一種基于磁矩不為零的原子核在外磁場作用下自旋能級發(fā)生塞曼分裂,共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過程,由Purcell和Bloch在1946年發(fā)現(xiàn)[79]。NMR是化學(xué)分析中的一項重要技術(shù),Lee等[80]將用于NMR測量的微線圈嵌入到微流控芯片的中間層,用抗體和外泌體作用后與磁性納米顆粒進行偶聯(lián),使用內(nèi)置微線圈進行核磁共振測量,以確定樣品的R2值,實現(xiàn)了對外泌體膜蛋白的檢測。

4.4 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dPCR)是一種絕對定量的方法,它將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系,平均分配成上萬個和數(shù)百萬個PCR反應(yīng),使每個反應(yīng)中盡可能含有一個模板分子,在單分子水平上進行大規(guī)模的平行PCR分析[81]。dPCR檢測目標(biāo)基因更可靠,不需要校準(zhǔn)曲線。由于其高靈敏度,dPCR已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域,包括單細(xì)胞分析、突變檢測、拷貝數(shù)變異分析、細(xì)菌和病毒檢測等?？梢栽O(shè)想,隨著微尺度樣品處理與dPCR分析的集成,該技術(shù)將成為臨床樣本中外泌體基因分析的有力工具[82]。

4.5 電化學(xué)傳感

電化學(xué)分析方法因其具有成本低、時效性好、靈敏度高、樣品量少等優(yōu)點在生化檢測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。在電化學(xué)檢測過程中,將識別元件(如抗體、適配體等)修飾到化學(xué)電極上與外泌體特異性結(jié)合,再利用不同的電化學(xué)檢測技術(shù)(包括伏安法、安培法、阻抗法、電位法等)對電極進行檢測便可以獲取樣品中外泌體的濃度和表面蛋白等信息。Revzin等[83]報道了一種基于適配體的電化學(xué)生物傳感器用于外泌體的定量檢測:將外泌體跨膜蛋白CD63適配體固定在金電極表面上與含有亞甲基藍(lán)標(biāo)記的探針鏈雜交,當(dāng)檢測到外泌體時,探針鏈會釋放出來,電化學(xué)信號以與分析物濃度成正比的方式降低;將該裝置整合到微流控芯片中,可以對外泌體濃度在1×106～1×108個粒子/mL的樣本進行定量檢測。Ye等[84]則以聚二甲基硅氧烷為主要材料,構(gòu)建了內(nèi)部含有人字形微陣列結(jié)構(gòu)的電化學(xué)檢測芯片(見圖7),當(dāng)檢測到外泌體跨膜蛋白CD63時,吸附有外泌體的磁珠可與一種DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合,在血清素的作用下,發(fā)卡結(jié)構(gòu)異構(gòu)成G-四聚體結(jié)構(gòu),對過氧化氫分解具有高效的催化作用,而產(chǎn)生強烈的電化學(xué)信號,從而實現(xiàn)對外泌體的檢測;在對臨床血清樣品中CD63陽性外泌體定量檢測中,文中開發(fā)的兩步級聯(lián)微流控平臺,可以實現(xiàn)對健康組和疾病組的外泌體含量的靈敏區(qū)分。

圖7 電化學(xué)傳感檢測外泌體Fig. 7 Exosomes detection by electrochemical sensorMagnetic-based microfluidic device for on-chip isolation and detection of tumor-derived exosomes[84].

5 總結(jié)與展望

本文主要對現(xiàn)有的外泌體分離分析方法進行了綜述,重點介紹了微流控技術(shù)在外泌體分離分析領(lǐng)域的研究進展。相較于傳統(tǒng)的超速離心、超濾、免疫捕獲及共沉淀,微流控技術(shù)體系更小,更加靈活,微流控免疫親和方法可以分離出高純度的外泌體,特異性強;基于外泌體物理特性的分離方法不需加入抗原抗體等昂貴試劑,成本低,分離過程不會引起外泌體表型變化,利于下游分析;基于微流控技術(shù)的外泌體分析方法分析速度快、通量高、試劑消耗少,可滿足大量臨床樣本中外泌體的快速檢測需求。因此,微流控技術(shù)在針對臨床少量樣本的外泌體分離及疾病快速檢測等方面具有顯著優(yōu)勢,為外泌體分離與分析提供了一個新的平臺。

盡管微流控技術(shù)在外泌體分離分析領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著進展,但是目前通常需要和一些儀器如注射泵、熒光檢測儀等進行聯(lián)用,這在一定程度上限制了其應(yīng)用場景。此外,因為外泌體尺寸小且密度和體液相近,單一的分離方法存在不足。如何平衡微流控芯片上外泌體純度和回收率的關(guān)系,也面臨很大的挑戰(zhàn)。近年來,隨著微納制造、新材料、信息技術(shù)的快速發(fā)展,基于微流控技術(shù)的外泌體分離分析芯片的設(shè)計和配套裝置性能將會獲得進一步提升,主要體現(xiàn)在:(1)精密制造工藝的發(fā)展使在一塊芯片上集成多種外泌體分離手段及實現(xiàn)外泌體分離檢測一體化成為可能;(2)將芯片和便攜式檢測設(shè)備結(jié)合,構(gòu)建微型化的外泌體微流控分離分析平臺,實現(xiàn)外泌體的快速檢測,大大拓展了其應(yīng)用空間。隨著微流控外泌體分離分析裝置的微型化、集成化、自動化,微流控芯片技術(shù)將在外泌體分離、生化檢測、機制研究等方面將發(fā)揮越來越重要的作用。