張 濤，孟金來,2*

(1.山東大學附屬省立醫(yī)院,濟南 250021；2.山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院,濟南 250021)

子癇前期(pre-eclampsia，PE)嚴重威脅母嬰健康,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡率升高的重要原因[1],約3%～5%的孕婦患有PE。PE是多病因、多機制、多階段發(fā)展的復雜病理過程。隨著研究深入,Redman[2]將發(fā)病機制從“二階段學說”細化為“六階段模式”，其中第四階段即指進入妊娠后半期，各種胎盤源性的損傷因子釋放進入母體血液循環(huán)，可引起血管內(nèi)皮損傷和促進系統(tǒng)性炎性反應的激活。血管內(nèi)皮細胞作為機體屏障，具有調(diào)節(jié)血管舒縮、物質(zhì)交換及吞噬細菌等作用，而PE的高血壓、靶器官受損的臨床癥狀證明出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能障礙。本文對胎盤外泌體對PE發(fā)病中發(fā)生血管內(nèi)皮損傷的機制進行綜述，為疾病預測及治療提供依據(jù)。

1 PE與外泌體

外泌體是由活細胞釋放的納米囊泡(50～100nm)，為脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)[3]。這些小泡可來自多種細胞[4]，廣泛存在于體液中,包括血液、尿液、脊髓液、母乳和唾液等[5]。納米囊泡是細胞膜和胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)、RNA以及負責細胞間遺傳物質(zhì)交換的載體，參與多種細胞外功能。正常妊娠中，胎盤細胞分泌的外泌體在妊娠6周就在母體循環(huán)中被發(fā)現(xiàn)，其濃度隨著孕周的增長而增加[6]。滋養(yǎng)細胞分泌的攜帶胎盤特異蛋白和微小RNA的外泌體可介導胎盤與母體之間的細胞通訊，并產(chǎn)生相應的生物學效應[6]。有研究表明缺氧環(huán)境誘導外泌體分泌的增加[7]。目前可以分離并標記從胎盤細胞釋放的外泌體[5]，并證明滋養(yǎng)細胞釋放的外泌體具有生物活性，可調(diào)節(jié)細胞靶向的生物學功能。在病理妊娠時，如PE孕婦胎盤分泌的外泌體組份會發(fā)生改變，在PE的發(fā)病中產(chǎn)生作用。

早發(fā)型PE和晚發(fā)型PE外周血中外泌體總數(shù)均較正常妊娠增加，但Pillay等[8]發(fā)現(xiàn)兩者間胎盤來源外泌體的相對濃度存在顯著差異，早發(fā)型PE外泌體與總外泌體數(shù)之間呈正相關(guān)，而在晚發(fā)型PE中兩者呈負相關(guān)，這可能與其病因?qū)W上的差異有關(guān)，表明胎盤來源的外泌體可能在PE病理變化中起作用。

2 外泌體在血管內(nèi)皮損傷中的作用

一項對PE孕婦與正常孕婦胎盤血清微囊泡miRNA表達的研究發(fā)現(xiàn)，PE孕婦血清樣本中22種miRNA表達差異顯著，臍帶血血清樣本中8種miRNA表達差異顯著。而胎盤樣本中11種miRNA與PE表達相關(guān)[9]。3種來源的樣本與PE表達相關(guān)的微小RNA具有一定相關(guān)性，如microRNA簇現(xiàn)象，多種miRNA與血管內(nèi)皮調(diào)控相關(guān)[9]，且微囊泡中miRNA降解較少，含量穩(wěn)定，來源單純，較血清中游離的部分，靈敏度高，更適合作為疾病的診斷標記物。

2.1 誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡 內(nèi)皮細胞內(nèi)和周圍環(huán)境中活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的生成在內(nèi)皮細胞活化和功能障礙中起著重要作用。有研究證實，膿毒癥中血小板來源的外泌體可從血漿中檢測到，血小板源外泌體具有NADPH氧化酶和一氧化氮合酶[10]，這些微顆粒與血管內(nèi)皮細胞一起孵育可通過NADPH氧化酶依賴通路在體外誘導細胞凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-221/222在ox-LDL誘導的人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilicalvein endothelial cells,HUVECs)凋亡中表達明顯下調(diào)。miR-221/222抑制可增強內(nèi)皮細胞凋亡，而miR-221/222過表達可通過抑制Ets-1及其下游靶蛋白p21，部分減輕ox-LDL介導的凋亡性細胞死亡[11]。

2.2 在氧化應激及炎癥反應中的作用 研究表明，來自不同組織的外泌體能誘導靶細胞中ROS的生成，如間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體減少了ROS的生成[12]。ROS可引起全身炎性反應,誘導滋養(yǎng)層細胞的凋亡從而影響滋養(yǎng)層細胞的浸潤能力,還可引起內(nèi)皮源性舒張因子NO的失活,使血管舒張不良、內(nèi)皮功能障礙,在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中起作用。

Hadley[13]用羊膜上皮細胞外泌體處理子宮肌層及蛻膜細胞，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8和PGE2的分泌增加,通過激活NF-κB調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和其他炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，導致母體子宮細胞炎癥反應增加,IL-6水平升高可刺激血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(angiotensinⅡtype 1 receptor-activating antibody,AT1-AA)的產(chǎn)生，AT1-AA還刺激組織因子和NADP氧化酶的產(chǎn)生，在血管損傷和氧化應激中發(fā)揮作用。此外，miR-155和miR-221/222通過靶向血管緊張素II(angiotensinⅡ,AngII)刺激HUVECs中的AT1R或轉(zhuǎn)錄因子Ets-1參與內(nèi)皮細胞炎癥和遷移[11,14]。

絨毛外滋養(yǎng)層細胞(extravillous trophoblast,EVT)釋放的胞外小泡(small extracellular vesicles,SEV)在妊娠早期調(diào)節(jié)子宮螺旋動脈重構(gòu)。有研究在1%O2(缺氧)和8%O2(常氧)培養(yǎng)的HTR-8/SVneo細胞分離的SEV中鑒定到507個差異豐富的蛋白質(zhì)，它們主要與炎癥相關(guān)的途徑有關(guān)[15]。研究中體外低氧SEV與內(nèi)皮細胞孵育后，GM-CSF、IL-6、IL-8和VEGF的釋放明顯升高；孕鼠體內(nèi)注射低氧SEV后，平均動脈壓明顯升高，收縮壓和舒張壓均升高。證明氧分壓調(diào)節(jié)EVT中SEV的釋放和生物活性，并且這些SEV調(diào)節(jié)炎癥和母體血壓，缺氧胎盤釋放的胎盤細胞來源的SEV可能參與了子癇前期的生理病理過程。

2.3 對血管舒張功能的作用 外泌體內(nèi)包含多種miRNA，一些miRNA參與了腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin-System，RAS)功能和AT1-AA的產(chǎn)生，PE患者胎盤miRNA-155表達上調(diào)[16]，抑制miR-155可增加AT1-R表達，增強AngII誘導的磷酸化erk1/2的活化。此外，與正常胎盤相比，PE胎盤中miRNA-21表達明顯上調(diào)，miRNA-21通過調(diào)節(jié)一氧化氮合酶的表達，干擾內(nèi)皮依賴的血管舒張功能等[4]。此外，內(nèi)皮素(endothelin，ET)是一種內(nèi)源性長效血管收縮調(diào)節(jié)因子，是由內(nèi)皮細胞受刺激合成分泌，ET-1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強的縮血管物質(zhì)。PE孕婦因胎盤缺血缺氧，ET-1含量明顯升高，血管舒縮功能紊亂是導致PE發(fā)病的關(guān)鍵之一。

3 外泌體與血管生成

血管生成需要血管內(nèi)皮細胞的管腔結(jié)構(gòu)的建立和重塑,外泌體攜帶多種細胞因子、miRNAs參與血管生成的調(diào)節(jié)，在PE患者血管生成中扮演重要的角色。

3.1 在促血管生成中的作用 在母體水平，VEGF通過刺激NO和前列環(huán)素的產(chǎn)生，維持腎、肝和腦中有孔內(nèi)皮細胞的健康，穩(wěn)定內(nèi)皮細胞。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，正常妊娠與PE患者外泌體miRNA表達存在明顯差異，其中血清樣本中，參與調(diào)控VEGF表達的有miRNA-320c、miRNA-517b、miRNA-521等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)外泌體在體內(nèi)和體外都具有促血管生成作用[17]，研究中對MSC外泌體蛋白組分析發(fā)現(xiàn)血管生成相關(guān)通路的高表達:鈣黏蛋白、EGFR、FGF和PDGF，及MSC外泌體通過NF-κB途徑在內(nèi)皮細胞中誘導血管生成。

最近研究發(fā)現(xiàn)，細長聚球藻[18]主要通過功能性EV的遞送，IL-6表達增加可能是其誘導的促血管生成和傷口愈合作用的機制。從動脈粥樣硬化患者外周血中分離的外泌體于大鼠后肢缺血模型局部注射可使缺血部位新生血管的增加[19]。體外和體內(nèi)實驗[20]表明，來自循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的外泌體將與PI3K/Akt信號通路和miR-126和miR-296等促血管生成相關(guān)的miRNA轉(zhuǎn)移到受體ECs中，激活PI3K/Akt信號通路，促進血管生成。

碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9)是由低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF1)在低氧條件下誘導的，在包括腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)在內(nèi)的多種腫瘤中均有過表達。最近研究發(fā)現(xiàn)，超離心分離的腎癌細胞外泌體中檢測到大量CA9[21]，CA9通過促進HUVEC的遷移和成管促進血管生成，且檢測到MMP-2水平升高，而MMP-9水平?jīng)]有升高，這對細胞遷移和侵襲都至關(guān)重要，表明MMP-2可能至少參與了CA9外泌體促進血管生成的作用[21]。

3.2 在抗血管生成中的作用 抗血管生成因子包括可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)、可溶性內(nèi)皮素(soluble endoglin,sEng)、纖溶酶原激活物抑制劑1、生長因子抑制劑、炎性細胞因子、ROS或超氧陰離子、缺氧誘導因子和AngⅡ抗體受體。目前研究發(fā)現(xiàn)，sFlt-1與早發(fā)型PE關(guān)系較為緊密，sFlt-1是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盤生長因子(placenta growth factor，PIGF)受體的可溶形式；sFlt-1不直接參與血管生成，是血管生成的負調(diào)節(jié)劑[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，PE的外泌體表達了大量的sFlt-1和sEng，且介導sFlt-1和sEng向內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)移,損害PE患者的血管功能并誘發(fā)并發(fā)癥。研究中分離收集了高水平sFlt-1和sEng的外泌體，并在人胚胎腎293細胞中過表達，且在體外證明這些外泌體能減弱HUVEC的增殖、遷移和管形成能力[7]。在小鼠模型中，PE患者的外泌體引起的血管功能障礙直接導致不良的子癇前期樣分娩結(jié)局。

有研究表明，與正常妊娠相比，PE患者體內(nèi)外泌體miRNA-16表達水平增高[17]，miRNA-16傳遞至內(nèi)皮細胞后靶向內(nèi)皮細胞下調(diào)VEGF表達，抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移,抑制血管生成[23]。研究發(fā)現(xiàn),臍帶血來源的外體miR-125a-5p在PE胎盤組織中的表達高于正常對照組，而VEGFA在PE胎盤組織中的表達低于正常對照組，將miR-125a-5p模擬物組與陰性對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)模擬物組細胞遷移、增殖和血管生成能力降低[24]，更多的細胞阻滯在S期，證實miR-125a-5p的表達異?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)VEGFA影響HTR8/SVneo細胞的增殖和遷移，抑制血管生成，參與了PE的發(fā)生發(fā)展。

4 展 望

PE的臨床發(fā)病機制尚未完全明確，血管內(nèi)皮損傷可能參與其發(fā)生及發(fā)展。在PE早期，胎盤產(chǎn)生的外泌體數(shù)量、內(nèi)容物及活性發(fā)生了改變，在PE血管內(nèi)皮損傷的發(fā)病機制中起重要作用。目前如何對各種細胞來源的外泌體分離鑒定，并明確其靶細胞與功能，仍需進一步探索。進一步深入探索胎盤組織分泌的外泌體的生物學機制，有助于為早期診斷和治療PE提供新思路。