熊強強，屠 俊，李郡如，3，程金科，左建宏#，陳亞蘭#

1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，衡陽421001；2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細胞生物學(xué)系，上海市腫瘤微環(huán)境與炎癥重點實驗室，上海200025；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2016級臨床醫(yī)學(xué)八年制，上海200025

蛋白質(zhì)翻譯后修飾的存在極大豐富了蛋白質(zhì)的多樣性，而且為蛋白質(zhì)響應(yīng)刺激和發(fā)揮功能提供了精密的調(diào)控方式。細胞內(nèi)存在大量的磷酸化和乙酰化等化學(xué)修飾，這些修飾的供體主要是ATP 和乙酰輔酶A 等，它們是物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物；與此不同，泛素和類泛素家族屬于小分子蛋白質(zhì)，它們是由基因編碼的，并帶有特定的“使命”。目前已知，泛素化修飾與蛋白酶體降解途徑密切相關(guān)［1］，自噬相關(guān)蛋白質(zhì)12（autophagy related 12，ATG12）修飾則與自噬過程密切相關(guān)［2］。人體內(nèi)小分子泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化修飾是由活化酶、接合酶和連接酶介導(dǎo)的，而SUMO 的成熟和去修飾過程則由6 種SUMO特異性蛋白酶（SUMO/sentrin-specific proteases，SENPs）催化完成［3］。SUMO 化修飾廣泛存在于細胞內(nèi)各個組分，參與了基因表達、代謝調(diào)控、免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生發(fā)展等諸多生理病理調(diào)控過程［4］，但目前對其主要“使命”尚不明確。對SUMO 化修飾蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)化鑒定和研究，有助于了解SUMO 化修飾的時空分布、響應(yīng)信號、作用機制和功能表型等，而這些都需要建立在掌握特定的SUMO 化修飾研究方法的基礎(chǔ)上。盡管SUMO 化修飾非常重要，但由于SUMO 本身的序列特征和修飾豐度問題，鑒定SUMO 化修飾位點一直是本領(lǐng)域的熱點和難點。本文對利用質(zhì)譜規(guī)?；芯坎溉閯游镏蠸UMO 化修飾的方法進行總結(jié)，供開展相關(guān)研究的學(xué)者們參考。

1 SUMO化修飾的規(guī)?；b定概述

要從全局性角度觀察SUMO化修飾在特定細胞或組織中的狀態(tài)和變化，需要通過蛋白質(zhì)組學(xué)的手段規(guī)?；b定SUMO 化修飾位點。從2004 年到2019 年，已經(jīng)有近百篇涉及SUMO化修飾組學(xué)的文獻，其中大部分聚焦于哺乳動物中的SUMO化修飾。此外，還有一些介紹植物或線蟲中的SUMO化修飾組學(xué)的研究［5-6］，在此不作討論。

在這16年的研究中，從研究成果的數(shù)量來看，2014年和2015 年的成果最多（圖1A）；從鑒定到的修飾蛋白質(zhì)和修飾位點來看，2017 年和2018 年的成果最豐（圖1B、C）。從總體研究趨勢來看，2004 年多篇人源細胞中SUMO 化修飾組學(xué)研究成果陸續(xù)被發(fā)表，數(shù)十個修飾蛋白質(zhì)被鑒定，但均未鑒定到修飾位點。2005—2008年，通過串聯(lián)親和純化技術(shù)富集SUMO 化修飾蛋白質(zhì)以及通過突變SUMO 蛋白鑒定修飾位點的技術(shù)路線逐步被建立［7-8］。2009—2013年，得益于細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記（stable-isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC）定量技術(shù)和高分辨率質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，SUMO化修飾組學(xué)的研究又開始逐漸增多。在此期間，研究人員針對SUMO 蛋白質(zhì)的C 端序列進行改造，獲得了具體的修飾位點［9-10］。在2011 年和2013 年出現(xiàn)了針對細胞內(nèi)源性SUMO 化修飾蛋白質(zhì)進行鑒定的研究，但均未能鑒定到修飾位點［11-12］。在2014 年和2015 年，SUMO 化修飾組學(xué)的研究達到高潮，在此期間學(xué)者們對SUMO 蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行了多種改造，對富集和洗脫方法也進行了優(yōu)化，鑒定到的修飾位點數(shù)目有了顯著增加。2016年出現(xiàn)了多篇綜述性論文［13-16］，但研究成果數(shù)量較少。在2017 年和2018 年，得益于SUMO 突變模式、刺激條件、富集方法、搜庫設(shè)置的成熟和Q-ExactiveTM等高性能質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，SUMO 化修飾蛋白質(zhì)和修飾位點的鑒定數(shù)目達到頂峰，且內(nèi)源性SUMO 化修飾也能鑒定出大量修飾位點［17］。在2019年，由于SUMO化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)相對成熟，規(guī)?；b定SUMO 化修飾蛋白質(zhì)和修飾位點被應(yīng)用在SUMO 化修飾的功能實驗中［18-19］，而專門針對SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究數(shù)量有所減少。下文我們主要從SUMO 蛋白質(zhì)改造和富集方法方面重點論述，并總結(jié)在細胞和組織水平進行SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的最優(yōu)路線。

圖1 哺乳動物中SUMO化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析Fig 1 Analysis of proteomic study on protein SUMOylation in mammals

2 通過改造SUMO以鑒定修飾位點

在人體中，SUMO存在5種旁系同源物［4，20-21］，研究較多 的 是SUMO1、SUMO2 和SUMO3，其 中SUMO2 和SUMO3 的成熟蛋白質(zhì)序列高度一致，難以區(qū)分，所以通常合并研究。這些SUMO的C端缺少賴氨酸或精氨酸，在經(jīng)過胰酶酶解后，SUMO1和SUMO2/3分別會在修飾底物上殘留包含19或32個氨基酸的長鏈多肽，不利于質(zhì)譜鑒定修飾位點。因此，為方便質(zhì)譜鑒定，需要對SUMO進行改造。目前，常用的改造模式為SUMO1-T95R［22］、SUMO2-K0Q87R［23］和SUMO3-Q87RQ88N［24］，這些突變改造都使SUMO1、SUMO2 或SUMO3 產(chǎn)生在胰酶酶解后便于質(zhì)譜鑒定的殘留序列，依次分別為GG-K、QQTGG-K 和NQTGG-K，據(jù)此可以鑒定修飾位點。當谷氨酰胺在N 端時容易環(huán)化，QQTGG-K 轉(zhuǎn)變成pyroQQTGG-K［25-26］；而NQTGG-K 容易發(fā)生中性丟失產(chǎn)生TGG-K［27］，這些也是鑒定位點的搜庫指標。我們注意到在這些研究工作中，SUMO1 和SUMO3 的序列計數(shù)包含了首位甲硫氨酸；而對SUMO2，研究者在計數(shù)其序列時去除了第一個甲硫氨酸，所以經(jīng)過胰酶酶解后得到的殘留肽段仍然是QQTGG。在SUMO2-K0Q87R 中，研究者們將SUMO2上所有的賴氨酸突變成了精氨酸，這樣用賴氨酸內(nèi)肽酶（Lys-C）進行酶解后，SUMO2 不會受到任何切割，仍然保持完整性，因而可以利用其N 端帶的His tag再次純化，進一步富集修飾肽段［23］。在SUMO3-Q87RQ88N 中，研究者將第88 位的谷氨酰胺突變成天冬氨酸，這樣可以避免N 端的谷氨酰胺在實驗過程中發(fā)生改變［27］。上述突變?yōu)橘|(zhì)譜鑒定修飾位點提供了便利，然而由于突變位點靠近SUMO與靶蛋白質(zhì)的接合之處，且研究者們沒有對野生型SUMO 蛋白質(zhì)和突變型SUMO 蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的結(jié)合蛋白質(zhì)進行全面細致的比較［10，23，27］，因而對于突變對SUMO本身修飾行為的影響難以進行全面準確的判定。盡管存在此類風(fēng)險，但通過突變改變SUMO 的蛋白質(zhì)序列在樣品處理過程中操作便捷，鑒定位點的成功率高，受到大多數(shù)研究者的青睞；故此策略仍是當前的主流研究方案。

如果不對SUMO 進行突變，則需要引入多酶進行酶解。例如，對于SUMO1，Cai 等［28］采用Lys-C 和谷氨酸內(nèi)肽酶（Glu-C） 酶解，得到QTGG 殘留肽段；對于SUMO2/3，Hendriks 等［17］采用Lys-C 和天冬氨酸內(nèi)肽酶（Asp-N）酶解，得到DVFQQQTGG 殘留肽段；Lumpkin等［29］采用一種野生型α 裂解蛋白酶（WaLP）在蘇氨酸的C端進行切割，從而使SUMO1/2/3都能產(chǎn)生GG殘留肽段；不過WaLP能夠在多種氨基酸附近進行不同程度的切割，其特異性還需要提高，產(chǎn)生結(jié)果的準確性還有待驗證。多酶酶解方案既縮短了殘留片段以便于后續(xù)質(zhì)譜鑒定修飾位點，又不會影響體內(nèi)SUMO 本身的修飾行為，是未來很有前景的發(fā)展方向，特別是在鑒定內(nèi)源SUMO的修飾位點方面。未來需要在酶的特異性、有效性和經(jīng)濟性上進行優(yōu)化，以提高鑒定位點的成功率和準確性。

3 通過親和純化富集修飾的蛋白質(zhì)

在2004 年開展的研究中，研究者們在SUMO 上融合不同的標簽，對修飾蛋白質(zhì)進行富集。有的利用His tag在變性條件下進行富集［30］，也有的利用Myc tag 或者HA tag在非變性條件下進行富集［31-32］。His tag與Ni的相互結(jié)合不受尿素和鹽酸胍等變性溶液的影響，利用變性溶液可以消除大量非共價相互作用，從而去掉一些SUMO 相互作用蛋白質(zhì)，得到的共價接合的修飾蛋白質(zhì)相對更多。此外，變性溶液可以在一定程度上抑制去修飾酶SENPs和其他蛋白酶，從而減少蛋白質(zhì)提取過程中SUMO 修飾蛋白質(zhì)的降解或去修飾，增加修飾蛋白質(zhì)的鑒定率。然而，利用His tag 富集修飾蛋白質(zhì)的特異性不高，這主要是由于真核生物中有較多含poly-His的蛋白質(zhì)，這些都可能被Ni 富集下來，產(chǎn)生假陽性。針對這一問題，可通過在蛋白質(zhì)結(jié)合過程中加入少量咪唑和在清洗過程中降低溶液的pH 值加以改善?；贖is tag 的理論優(yōu)勢和實際效果，研究人員在后續(xù)細胞水平的規(guī)?；芯恐写蟛糠植捎昧薍is tag。這樣，可以在蛋白質(zhì)富集過程中盡可能多地富集SUMO 化修飾蛋白質(zhì)，減少假陰性率，而在后續(xù)搜庫過程中，通過鑒定到具體修飾位點而減少假陽性率。

除了利用融合標簽進行富集外，還有研究者利用SUMO 的抗體富集內(nèi)源性SUMO 的修飾蛋白質(zhì)，這對于難以進行轉(zhuǎn)染操作的組織樣品非常重要［17，28］。在最初的研究中，利用SUMO1 或SUMO2/3 抗體富集的是修飾蛋白質(zhì)而非修飾肽段，不僅富集效率低，得到的非修飾肽段多，而且難以鑒定到修飾位點。2017 年本課題組首次報道了規(guī)模化鑒定內(nèi)源性SUMO 的修飾位點的方法［28］。在此方法中，我們合成了將SUMO1 的C 端連接在靶蛋白賴氨酸ε-NH3 上的支鏈肽段，以此為抗原制備了SUMO1的多克隆抗體（TC）。利用此抗體，我們可以富集經(jīng)過Lys-C 酶解后的SUMO1 修飾肽段，并經(jīng)過Glu-C 酶解后鑒定到具體修飾位點。此后，又有研究者設(shè)計制備了抗NQTGG 的抗體［27］，或直接利用商業(yè)化的識別SUMO2/3 C 端的抗體（8A2）富集修飾肽段，并用Asp-N 酶解鑒定到了具體修飾位點［17］。值得一提的是，利用商業(yè)化的GG-K 抗體也能有效富集SUMO 化修飾肽段［22，33］，這種方法可以整合在標簽純化和抗體純化過程中［27］，從而增加純度，有利于提高修飾位點的鑒定率。

綜上，對于能夠轉(zhuǎn)染的細胞而言，最有效便捷的富集方式還是使用His tag；而對于不便轉(zhuǎn)染的組織樣品，使用SUMO 的C 端抗體富集修飾肽段則是首選之策。此外，這2種方法還可以結(jié)合起來，增加樣品純度以提高修飾位點的鑒定率。

4 細胞樣品的SUMO化修飾組學(xué)研究

細胞是研究SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)最便捷的樣品，可以通過轉(zhuǎn)染操作進行過表達，還可以對SUMO 序列進行改造，因而鑒定得到更多的修飾位點。通過對培養(yǎng)細胞樣品的SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法和結(jié)果進行分析和比較，我們發(fā)現(xiàn)了針對SUMO1、SUMO2 和SUMO3最有效的研究策略（圖2）。

圖2 細胞樣品中鑒定SUMO修飾位點示意圖Fig 2 Sketch map of identification of SUMOylation sites in cell samples

對于SUMO1，首先在細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6His-SUMO1-T95R，根據(jù)需要進行刺激或直接收集細胞。用含有鹽酸胍和多種蛋白酶抑制劑的變性裂解液提取蛋白質(zhì)，并用Ni-NTA磁珠富集SUMO1修飾蛋白質(zhì)。利用咪唑洗脫后再用胰酶酶解得到肽段，將這些肽段用GG-K試劑盒進行第2輪富集，而后進行質(zhì)譜鑒定。最初用Ni-NTA一步富集只能鑒定得到14個SUMO1修飾位點［9］，而研究者們進一步采用GG-K 富集后可以鑒定得到295個SUMO1修飾位點，近期用此方法將鑒定位點數(shù)目進一步擴大到了1 428 個修飾位點［22，34］。由此可見，2 輪富集得到的效果可能更好。如果起始樣品很多，可以在質(zhì)譜鑒定前使用強陽離子交換或高pH 色譜預(yù)分離，以鑒定到更多的修飾蛋白質(zhì)和修飾位點［17，27］。在質(zhì)譜選擇上，現(xiàn)在通常需要Q-Exactive或更高級別的質(zhì)譜，以增強掃描速度和識別精度。在搜庫中，通過設(shè)置GG-K可變修飾來鑒定修飾位點。

對于SUMO2，首先在細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染10His-SUMO2-K0Q87R，可以通過熱休克和蛋白酶體抑制劑MG132 刺激增強修飾，然后收集細胞并在變性條件下利用Ni-NTA磁珠富集SUMO2 修飾蛋白質(zhì)。洗脫后用Lys-C 酶解并再次用Ni-NTA 磁珠富集SUMO2 修飾肽段，經(jīng)過胰酶酶解后進行質(zhì)譜鑒定。色譜和質(zhì)譜選擇同上述SUMO1鑒定方案。在搜庫中，通過設(shè)置QQTGG-K 和pyroQQTGG-K 鑒定修飾位點［35］。

對于SUMO3，首先在細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6His-SUMO3-Q87RQ88N。由于SUMO3 和SUMO2 均能響應(yīng)熱休克和MG132 刺激而增加修飾，因而可對細胞進行這2 種刺激。收集細胞后用Ni-NTA 磁珠富集SUMO3 修飾蛋白質(zhì)。洗脫后通過胰酶酶解產(chǎn)生NQTGG殘留肽段，這些修飾肽段依次用GG-K 抗體和NQTGG-K 抗體富集，然后進行質(zhì)譜鑒定，色譜和質(zhì)譜選擇同上。在搜庫中，通過設(shè)置NQTGG-K和TGG-K鑒定修飾位點［27］。

5 組織樣品的SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究

對于來源于小鼠或人的組織樣本，難以進行轉(zhuǎn)染操作，需要鑒定內(nèi)源SUMO 的修飾位點。通過分析已發(fā)表的相關(guān)文獻并結(jié)合本課題組的近期研究，提出組織樣品的SUMO1 和SUMO2/3 的修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法（圖3）。我們前期在SUMO1修飾最豐富的小鼠睪丸中開展了首次鑒定組織樣品內(nèi)源SUMO 化修飾位點的工作［28］，其技術(shù)路線也可以應(yīng)用在其他組織樣品中。首先提取組織蛋白質(zhì)，在變性條件下用Lys-C 酶解。然后，用制備的SUMO1 抗體（TC） 富集SUMO1 修飾肽段，再經(jīng)過Glu-C 酶解后即可進行色譜分離和質(zhì)譜鑒定，通過QTGG-K 和pyroQTGG-K 鑒定修飾位點。需要指出的是，我們當初的工作中并未考慮通過pyroQTGG-K 鑒定修飾位點，但基于我們近期的研究測試，pyroQTGG-K 在SUMO1 的修飾位點鑒定中也廣泛存在，故提出將此加入可變修飾設(shè)置中。對SUMO2/3 的研究與此類似，差異在于需要用SUMO2/3 抗體（8A2）富集SUMO2/3 修飾肽段，在經(jīng)過Asp-N 酶解后進行質(zhì)譜鑒定［17］。由于Asp-N酶解特異性問題和切割位置，產(chǎn)生的肽段較長且具有多種中性丟失和切割模式，在搜庫時均需考慮。在搜庫軟件上，除了可以使用傳統(tǒng)的MaxQuant 和Mascot 外，pLink非常適合這種發(fā)生修飾的“交聯(lián)肽”的鑒定［28］。

圖3 組織樣品中鑒定SUMO修飾位點示意圖Fig 3 Sketch map of identification of SUMOylation sites in tissue samples

6 總結(jié)和展望

當前，隨著SUMO 突變模式和富集技術(shù)的完善，色譜質(zhì)譜技術(shù)的日益發(fā)展以及搜庫軟件的不斷更新，在全局水平鑒定蛋白質(zhì)的SUMO 化修飾位點的方法已經(jīng)比較成熟，這些方法也已經(jīng)廣泛應(yīng)用在功能研究中，為揭示SUMO 的主要功能提供了支持。值得注意的是，當前絕大部分的研究還是基于過表達和點突變策略來鑒定修飾位點，而鑒定內(nèi)源野生型SUMO 的修飾位點和定量變化則是未來的趨勢。另外，在個體化鑒定內(nèi)源SUMO 化修飾位點的研究中，減少細胞用量、簡化操作流程、增加鑒定成功率和陽性率將是未來努力的方向。