趙曉軍，喬志剛，梁挺宇，安艷玲

1.山西省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科，太原030013；2.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，太原030619

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，其生長(zhǎng)方式呈浸潤(rùn)性，具有極強(qiáng)的侵襲性，經(jīng)手術(shù)切除后患者的復(fù)發(fā)率較高、預(yù)后較差［1］。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）蛋白是一種組織特異性腫瘤抑制因子，能夠參與DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，且與紫杉醇、鉑類(lèi)及替莫唑胺等多種藥物的腫瘤耐藥性密切相關(guān)［2-4］。目前的研究顯示，BRCA1 表達(dá)異常與肺癌［5］、乳腺癌［6］等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但有關(guān)其在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，以及是否影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療（化療）藥物的敏感性尚不清楚。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)BRCA1 蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，分析其與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性，并進(jìn)一步通過(guò)體外抑制BRCA1 的表達(dá)，分析其對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺（temozolomide，TMZ）敏感性的影響，從而探索BRCA1 是否可作為腦膠質(zhì)瘤臨床治療的新靶點(diǎn)，以期為已對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性的腦膠質(zhì)瘤患者提供新的治療手段。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象、主要試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象 選擇2010 年1 月—2017 年12 月于山西省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤患者104 例作為研究組，同時(shí)選擇頭顱損傷行內(nèi)減壓手術(shù)治療的患者30 例作為對(duì)照組。研究組的納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤。②首次發(fā)病，術(shù)前未接受放射治療（放療）、化療、免疫治療及手術(shù)治療等。③無(wú)其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病例資料不全。②術(shù)前發(fā)生腫瘤卒中。③合并其他惡性腫瘤者。本研究已獲得山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批（審批號(hào)：20150817-L），所有參與本研究的患者均已簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.3 主要試劑與儀器 鼠抗人BRCA1 單克隆抗體（Santa Cruz，美國(guó)），羊抗鼠IgG聚合物（Proteintech，美國(guó)），DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Sigma，美國(guó)）；fDSP 彩色攝像系統(tǒng)（Biometra，美國(guó)），石蠟包埋機(jī)（Leica，德國(guó)），烤片機(jī)（沈陽(yáng)恒松科技有限公司），全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)（Leica，德國(guó)），基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技股份有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 患者資料收集、組織標(biāo)本獲取及處理 收集所有患者的年齡、性別等臨床資料；同時(shí)，收集研究組患者腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及對(duì)照組患者頭顱損傷腦組織標(biāo)本，參考世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)研究組患者的病理組織進(jìn)行分類(lèi)和分級(jí)。本研究所有患者的臨床資料及病理組織標(biāo)本均來(lái)自山西省腫瘤醫(yī)院病理科，所有組織在離體后迅速經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后待檢。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BRCA1蛋白表達(dá) 使用切片機(jī)將石蠟包埋后的2 組標(biāo)本制成厚約4μm 的切片，經(jīng)烤片、脫蠟、乙醇水化后用檸檬酸緩沖液高溫高壓行抗原修復(fù)，使用過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加鼠抗人BRCA1 單克隆抗體稀釋液（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后滴加羊抗鼠IgG 聚合物稀釋液（1∶100），室溫下孵育30 min，洗滌后滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶，室溫下孵育30 min 后行DAB 顯色。而后經(jīng)蘇木精復(fù)染、中性樹(shù)膠封片后，于顯微鏡下觀察。

BRCA1 蛋白表達(dá)判定如下：在400 倍鏡下隨機(jī)選取每張切片的5 個(gè)視野，通過(guò)染色強(qiáng)度評(píng)分及BRCA1 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)估。染色強(qiáng)度為0～3 分：0 分為無(wú)染色，1 分為弱陽(yáng)性，2 分為中陽(yáng)性，3 分為強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)為0～4 分：0 分為陽(yáng)性細(xì)胞百分比為0，1 分為1%～25%，2 分為26%～50%，3 分為51%～75%，4 分為76%～100%。將切片的2項(xiàng)得分累計(jì)相加，總分≤3分記為BRCA1陰性表達(dá)，總分＞3分記為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將U251 細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100μg/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，采用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 以3×103/孔將U251 細(xì)胞接種于6 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，將U251 細(xì)胞隨機(jī)分為3 組，使用Lipofectamine 2000 試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，即分別向3 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-BRCA1 沉默載體（sh-BRCA1 組）、shNC-BRCA1空表達(dá)載體（sh-NC 組）及空白對(duì)照磷酸鹽緩沖液（Blank組），而后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄及定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)BRCA1 mRNA 表達(dá) 使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative PCR，qPCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。使用TRIzol 提取3 組細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參。按照qPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)以cDNA為模板檢測(cè)BRCA1 mRNA 表達(dá)，引物序列如表1 所示。BRCA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT方法。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性及對(duì)TMZ 敏感性 收集轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液。按照說(shuō)明書(shū)步驟，將已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以3×103/孔接種至96 孔板中，每組（不同時(shí)間及濃度）均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。①細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔于450 nm處的吸光度D（450 nm）值。②TMZ敏感性檢測(cè)：于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，加入10 μL 不同濃度的TMZ 使孔中的TMZ 終濃度分別為0、50、100 及200μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h 后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔于450 nm處的吸光度D（450 nm）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定性資料采用率或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；定量資料以x±s 表示，采用One-way ANOVA 進(jìn)行組間比較；采用Kaplan-Meier 法計(jì)算生存率，使用Log-Rank 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者一般資料比較

本研究共納入104 例腦膠質(zhì)瘤患者，其中男性56 例、女性48例，年齡為18～67歲，平均年齡為（47.5±7.8）歲；病理組織分級(jí)顯示，62 例為Ⅰ～Ⅱ級(jí)，42 例為Ⅲ～Ⅳ級(jí)；病理組織類(lèi)型顯示，30 例為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，48 例為星形細(xì)胞瘤，26 例為少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤。本研究共納入30 例頭顱損傷患者，其中男性18 例、女性12 例，年齡為20～67歲，平均年齡為（45.2±8.1）歲。對(duì)患者的年齡及性別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示2組患者的年齡（P=0.321）、性別（P=0.690）間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 2組患者BRCA1蛋白表達(dá)的比較

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，BRCA1 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但在細(xì)胞核內(nèi)也有一定表達(dá)。在30 例對(duì)照組組織中有23 例為BRCA1 陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為76.67%；而在104 例腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中有33 例呈陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為31.73%；陽(yáng)性表達(dá)率的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009，圖1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BRCA1蛋白表達(dá)陰性和陽(yáng)性的鏡下示例（×400）Fig 1 Microscopic examples of negative and positive BRCA1 protein expression detected by immunohistochemistry （×400）

2.3 BRCA1蛋白表達(dá)與研究組患者臨床病理特征之間的關(guān)系

BRCA1 蛋白表達(dá)與患者的年齡、性別及病理類(lèi)型無(wú)顯著相關(guān)性，而在Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織中BRCA1 的陽(yáng)性表達(dá)率低于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022，表2）。

表2 BRCA1蛋白表達(dá)與研究組患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab 2 Relationship between BRCA1 protein expression and clinicopathological characteristics of the patients in the study group

2.4 BRCA1蛋白表達(dá)與研究組患者生存率的關(guān)系

Log-Rank 法分析結(jié)果（圖2）顯示，BRCA1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存率與陰性表達(dá)患者相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.109）。

2.5 BRCA1 mRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

采用qPCR檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果（圖3）顯示，BRCA1 在U251 細(xì)胞中（即Blank 組）有一定的表達(dá)，且在sh-BRCA1 組中的表達(dá)量低于sh-NC 組（P=0.037）和Blank組（P=0.035），說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后BRCA1 mRNA的表達(dá)水平Fig 3 Expression level of BRCA1 mRNA after transfection

2.6 抑制BRCA1表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞增殖活性的影響

采用CCK-8 法檢測(cè)U251 細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果（圖4）顯示，經(jīng)培養(yǎng)48、72 h后，sh-BRCA1組細(xì)胞的增殖 活 性高于Blank 組（P=0.043，P=0.037）和sh-NC 組（P=0.046，P=0.037）；說(shuō)明抑制BRCA1 表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

2.7 TMZ對(duì)U251細(xì)胞增殖活性的影響

經(jīng)不同濃度的TMZ 處理后，采用CCK-8 法檢測(cè)3 組U251細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果（圖5）顯示TMZ對(duì)U251細(xì)胞均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性；當(dāng)TMZ 濃度為100、200 μmol/L 時(shí)，sh-BRAC1 組的細(xì)胞活性顯著高于sh-NC 組（P=0.041，P=0.040）和Blank 組（P=0.038，P=0.042）。

圖4 抑制BRCA1表達(dá)對(duì)3組U251細(xì)胞增殖活性的影響Fig 4 Effect of inhibition of BRCA1 expression on proliferation activity of U251 cells in the three groups

圖5 不同濃度TMZ對(duì)3組U251細(xì)胞增殖活性的影響Fig 5 Effects of different concentrations of TMZ on proliferation activity of U251 cells in the three groups

3 討論

腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高，約占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的50%［7］。近年來(lái)，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人類(lèi)的生命健康。目前，手術(shù)切除、化療和放療是腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段，但患者的5年生存率仍低于5%［8］。有報(bào)道指出，BRCA1 在乳腺［6］、卵巢癌［9］等多種腫瘤中呈低表達(dá)，推測(cè)其可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。進(jìn)一步研究［10-11］表明，BRCA1蛋白能夠調(diào)控細(xì)胞周期，參與DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，且具有抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)的作用。研究［12］顯示，消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中BRCA1 和BRCA2 的低表達(dá)水平與腫瘤晚期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)BRCA1 和BRCA2 的患者預(yù)后較好。另有研究［13-14］表明，BRCA1在多種腫瘤中表達(dá)異常，且與患者的臨床病理特征存在一定相關(guān)性。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了對(duì)照組及研究組的BRCA1 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究組BRCA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于對(duì)照組，即BRCA1在腦膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，推測(cè)其可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。隨后，本研究分析了BRCA1 蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示BRCA1 的表達(dá)與患者的年齡、性別、病理類(lèi)型無(wú)顯著相關(guān)性，但與腫瘤病理分級(jí)顯著相關(guān)，說(shuō)明BRCA1 可能與腫瘤的惡性程度相關(guān)；但進(jìn)一步對(duì)BRCA1 與患者生存率之間的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，BRCA1 陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存率與陰性表達(dá)患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明BRCA1 可能在腦膠質(zhì)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。

目前，臨床上惡性腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段為手術(shù)并輔以TMZ化療及放療，但由于患者易對(duì)TMZ產(chǎn)生耐藥性，因此其治療效果并不理想。TMZ 主要通過(guò)干擾DNA復(fù)制、損傷DNA 來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。既往研究［15-16］顯示BRCA1 在DNA 損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此我們推測(cè)其可能參與了膠質(zhì)瘤患者TMZ 耐藥性產(chǎn)生的過(guò)程。Ding 等［17］研究發(fā)現(xiàn)BRCA1 是引起TMZ 誘導(dǎo)的P53 野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡的潛在靶點(diǎn)，抑制BRCA1能夠誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤sphere-forming細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物TMZ的敏感性，提示BRCA1可能成為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新靶點(diǎn)。本研究首先從臨床患者組織中證實(shí)了BRCA1 在腦膠質(zhì)瘤中低表達(dá)且與患者臨床病理特征具有一定的相關(guān)性，但是BRCA1 是否參與調(diào)控腦膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物敏感性尚不清楚。因此，本研究通過(guò)體外細(xì)胞水平探索了抑制BRCA1表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ敏感性的影響，通過(guò)構(gòu)建BRCA1 低表達(dá)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞模型，觀察不同濃度TMZ對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制BRCA1 表達(dá)能夠降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 對(duì)TMZ 的敏感性，推測(cè)其在膠質(zhì)瘤TMZ 化療耐藥中可能發(fā)揮了重要作用。

目前，關(guān)于BRCA1 蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對(duì)腦膠質(zhì)瘤耐藥性的影響報(bào)道較少，本研究初步探究了BRCA1 在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，同時(shí)在細(xì)胞水平上初步觀察了BRCA1 對(duì)腦膠質(zhì)瘤TMZ敏感性的影響，為進(jìn)一步探究BRCA1在腦膠質(zhì)瘤中的作用提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究尚存在一定的局限性：由于納入的樣本量較少，僅通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性來(lái)觀察BRCA1 表達(dá)對(duì)U251 細(xì)胞TMZ 敏感性的影響，未進(jìn)行深入的機(jī)制研究，使得本研究結(jié)果僅具有一定的代表性。因此，在今后的研究中我們?nèi)孕枰^續(xù)收集病理數(shù)據(jù)，擴(kuò)大樣本量及研究范圍，從分子及細(xì)胞水平深入探究BRCA1 在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中可能的作用機(jī)制，從而為腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的臨床治療提供一定的參考。