格桑卓瑪 金海 董燕 邊巴卓瑪 胡志文★,

1 林芝市人民醫(yī)院功能科 西藏林芝 860000

2 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科 廣東廣州 510180

VX2 是目前應(yīng)用較廣泛的惡性腫瘤瘤株，通過將該瘤株接種到兔的肺、肝、腎、軟組織、骨骼肌和腦中來建立動(dòng)物模型，用于研究多種腫瘤生物學(xué)行為，如腫瘤血管生成、發(fā)病機(jī)制和治療評(píng)估[1-4]。目前，肝癌兔原位移植瘤模型是人體外較為接近人類肝癌的整體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?因此成為肝癌實(shí)驗(yàn)研究理想的動(dòng)物模型,尤其利用肝癌細(xì)胞直接注射肝細(xì)胞接種建立肝癌原位移植瘤模型。但是，有關(guān)肝癌細(xì)胞接種前采用何種液體制懸未見明確報(bào)道。為此，在這項(xiàng)研究中我們選用VX2 兔肝腫瘤細(xì)胞，以不同的液體對(duì)肝癌細(xì)胞稀釋制懸后經(jīng)超聲引導(dǎo)接種于兔肝癌原位瘤模型建立兔肝VX2 的移植瘤模型，探討模型制備的最佳肝癌細(xì)胞制懸方法，為肝癌研究提供有效的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

44只重量為2.6kg～3kg的新西蘭大白兔，雌雄各半，由暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。瘤株類型為VX2 鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 方法

1.2.1 VX2 肌肉荷瘤種兔的制作

在制作前事先將水浴鍋恒溫在37 度，超凈臺(tái)紫外線照射滅菌，從液氮中取出凍存的VX2 腫瘤細(xì)胞液，在37 度水浴鍋中快速溶解，溶解后立刻轉(zhuǎn)移到放有DMEME 培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速為1000rpm/min，室溫下離心3 分鐘，棄掉上清液，收集沉淀細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，鋪散均勻轉(zhuǎn)到細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

由于接種到兔肌肉內(nèi)的細(xì)胞要達(dá)到一定的數(shù)量，因此對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖：首先待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時(shí)，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 液潤洗細(xì)胞1～2 遍，棄掉PBS 液，加入0.05%胰酶，放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行胰酶消化，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變時(shí)，吸棄胰酶，加入DMEM 完全培養(yǎng)基進(jìn)行吹打混勻，細(xì)胞全部消化下來后轉(zhuǎn)移到離心管中，1000rpm/min，3min，室溫狀態(tài)下離心，收集細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)基制成VX2 細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到2～3 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)待細(xì)胞增殖到一定數(shù)量后進(jìn)行荷瘤種兔的制作。取4 只重量在2.6kg-3.0kg（雌雄不限）的新西蘭大白兔，肌注麻醉后，用剃剪將后腿大腿外側(cè)皮膚剃毛，消毒，常規(guī)消化細(xì)胞收集細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液在Matrigel 的混合下注射到大白兔后腿肌肉內(nèi)成瘤。

1.2.2 VX2 肝移植瘤模型的建立

成瘤2～3 周后，待腫瘤直徑達(dá)到2cm 左右時(shí)，進(jìn)行腫瘤移植。將大白兔肌注麻醉并固定在兔臺(tái)上，常規(guī)消毒，用眼科剪小心剝離肌肉內(nèi)腫瘤。將剝離的腫瘤組織塊放入培養(yǎng)皿內(nèi)，再用眼科剪和鑷去除腫瘤組織周圍的肌肉組織、脂肪組織和血管，用生理鹽水清洗組織1～2次，然后用眼科剪將腫瘤組織剪碎至0.5 mm3 的組織碎塊，并將組織碎塊轉(zhuǎn)移到分別加有PBS 和Matrigel 混合溶液、無血清DMEM 和Matrigel 混合溶液、PBS 緩沖液和無血清DMEM 溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)制成腫瘤組織懸液。將40 只健康的重量相當(dāng)?shù)男挛魈m大白兔（雌雄不限）隨機(jī)分為4 組，每組10 只。肌注麻醉后將大白兔固定在臺(tái)上，常規(guī)消毒，鋪設(shè)洞巾，準(zhǔn)備好PTC 穿刺針和邁瑞M7 便攜彩色多普勒超聲儀、生理鹽水、明膠海綿顆粒、青霉素和手術(shù)器械。介入模型（如圖1），在邁瑞超聲引導(dǎo)下用18g 的PTC 穿刺針經(jīng)皮穿刺入肝臟內(nèi)，然后抽出穿刺針的針芯，用鑷子夾取組織碎塊放入到穿刺針的針尾，用針芯緩慢將腫瘤組織碎塊推注至肝內(nèi)，然后撤出穿刺針，后用青霉素40萬u/d肌肉注射，連續(xù)3天，防止感染，后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料應(yīng)用x±s 表示。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用率表示計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1：介入建模超聲圖像 A：超聲引導(dǎo)下18g 的PTC 穿刺針經(jīng)皮穿刺入肝臟內(nèi)；B：PTC 穿刺針針尖處的高回聲團(tuán)為推注入肝臟內(nèi)的腫瘤組織碎塊及伴隨的少量氣體。

2 結(jié)果

2.1 兔肌肉荷瘤模型

VX2 肌肉荷瘤種兔的制作4 只實(shí)驗(yàn)兔均造模成功。在成瘤3 周后，肝腫瘤的大小直徑達(dá)到2cm 左右。

2.2 兔肝癌原位瘤模型成瘤率的比較 見表

表1 4 組兔肝原位瘤大小和成瘤率

3 結(jié)論

采用DMEM 和Matrigel 混合制作兔VX2 肝癌細(xì)胞稀釋制懸后經(jīng)超聲引導(dǎo)是一種簡單、成功率高的建立兔肝癌原位瘤模方法。

4 討論

VX2 是目前應(yīng)用較廣泛的惡性腫瘤瘤株，通過將該瘤株接種到兔的肺、肝、腎、軟組織、骨骼肌和腦中來建立動(dòng)物模型，用于研究多種腫瘤生物學(xué)行為，如腫瘤血管生成、發(fā)病機(jī)制和治療評(píng)估。在這項(xiàng)研究中，通過超聲引導(dǎo)下的PTC 穿刺針經(jīng)皮穿刺入肝臟內(nèi)嵌入瘤組織塊建立兔肝VX2 的移植瘤模型。兔腫瘤模型具有制作簡便易行，價(jià)格相對(duì)低廉，實(shí)驗(yàn)周期短、成功率高、重復(fù)性好、模型性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)[5-10]。兔肝臟的左葉體積明顯大于右葉，左肝動(dòng)脈較粗大，大多數(shù)從腹腔動(dòng)脈直接發(fā)出，而右肝動(dòng)脈較細(xì)。同時(shí)為了方便操作，避免栓塞材料等進(jìn)入膽囊動(dòng)脈引起不必要的并發(fā)癥[11]。

常規(guī)肋下B 超或CT 掃查待接種兔肝臟,明確兔肝位置并確定待接種部位，選定穿刺點(diǎn)、角度、深度、常規(guī)消毒鋪巾，尖刀挑開穿刺點(diǎn)皮膚（術(shù)后瘢痕點(diǎn)可作為B 超或CT 監(jiān)測(cè)移植瘤的部位），用尖頭穿刺針沿設(shè)定的穿刺角度、方向穿入預(yù)定肝位置，助手固定好穿刺針，術(shù)者拔出針芯，眼科鑷夾1 塊瘤塊放入針鞘內(nèi)，穿刺針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復(fù)1～2 次，在直視下來回在針鞘內(nèi)推動(dòng)穿刺針芯，證實(shí)瘤塊接種于肝臟[12,13]。如未成功，可再重復(fù)上述操作，術(shù)后連續(xù)3天青霉素40 萬 U+慶大霉素4 萬U 肌注。采用直接穿刺法復(fù)制出的VX2 兔肝癌模型具有方法簡單，成功率高，模型性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)。同常規(guī)開腹接種法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：不需開腹，無開腹接種法常伴的出血多、損傷大、術(shù)中兔麻醉過淺不易操作，麻醉過深易致意外死亡；術(shù)后手術(shù)瘢痕影響超聲監(jiān)測(cè)等缺點(diǎn)，同懸液注射法相比：形成的腫瘤為孤立結(jié)節(jié)型而非彌漫性腫瘤，便于進(jìn)行肝癌的影像學(xué)研究，無腹腔種植，并且可根據(jù)研究需要調(diào)整模型，腫瘤在肝的位置。不過，由于兔肝小移動(dòng)性較大且分葉多，故在選兔時(shí)一般選擇體型較大的兔，為提高穿刺接種成功率，要求尖頭穿刺針銳利，穿刺針芯直徑與外套針內(nèi)徑吻合；穿刺時(shí)需一定的技巧：先用尖刀挑開擬穿刺處皮膚，再進(jìn)針，要求快防止瘤塊接種于肝葉之間的空隙中。

Matrigel 是一種從EHS 小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜成分。1990 年，Kleiman 等首次報(bào)道Matrigel可以有力地促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化；隨后，陸續(xù)有人利用Matrigel 將人癌細(xì)胞或組織（小細(xì)胞肺癌、人乳腺癌、腎癌、鱗癌以及前列腺癌）移植于裸鼠獲得成功[14-17]。本文通過PBS 和Matrigel 混合溶液、無血清DMEM 和Matrigel 混合溶液、PBS 緩沖液和無血清DMEM 溶液組共4 組的兔肝癌VX2 原位瘤模型，發(fā)現(xiàn)采用DMEM 和Matrigel 混合制作兔VX2 肝癌細(xì)胞稀釋制懸后經(jīng)超聲引導(dǎo)是一種簡單、成功率高的建立兔肝癌原位瘤模方法。這為我們以后建立肝原位瘤模型作相關(guān)活體研究提供了有力的條件。