於亭 宋繼科 魏慧霞 田慶梅 紀(jì)海峰 畢宏生 解孝鋒

近視是導(dǎo)致視力障礙的主要原因，并且正成為世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題。Holden等[1]預(yù)測(cè)，到2050年，將有47.58億近視患者(占世界人口的49.8%)和9.38億高度近視患者(占世界人口的9.8%)。近視的發(fā)展與眼軸的過度延長(zhǎng)相關(guān)，這種變化往往伴隨著鞏膜變薄[2]。鞏膜為眼球提供框架，以維持眼球的形狀和完整性，在改變眼球大小和屈光狀態(tài)方面起著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，在近視發(fā)展過程中，鞏膜中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)上升，造成鞏膜缺氧。因此，改善鞏膜缺氧將成為控制近視發(fā)展的一種有效治療方法。而電針作為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)具有改善組織血氧微環(huán)境及上調(diào)HIF-1α表達(dá)作用[5]，并且在治療近視方面已取得了一些臨床療效[6-7]。本研究旨在探討電針干預(yù)后透鏡誘導(dǎo)型近視(LIM)豚鼠鞏膜超微結(jié)構(gòu)變化及鞏膜中HIF-1α和脯氨酰羥化酶2(PHD-2)表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取2周齡雄性健康英國(guó)種三色短毛豚90只(購(gòu)自濟(jì)南西嶺角生物科技有限公司)，體質(zhì)量100～120 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入組前均排除白內(nèi)障、角膜病變、近視等眼病。飼養(yǎng)條件：室溫22～25 ℃，予以12 h/12 h的晝夜節(jié)律，環(huán)境光照強(qiáng)度300 lux。實(shí)驗(yàn)期間所有豚鼠自由攝食、進(jìn)水，并給予富含維生素的飼料及新鮮蔬菜等以補(bǔ)充維生素C。實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格遵守視覺與眼科動(dòng)物研究協(xié)會(huì)(the Statement of Animals Research in Vision and Ophthalmic，ARVO)原則。

1.1.2 主要試劑及儀器10 g·L-1鹽酸環(huán)噴托酯滴眼液(美國(guó)愛爾康公司)，4 g·L-1鹽酸奧布卡因(日本參天制藥株式會(huì)社)，體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液(國(guó)美集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；組織/細(xì)胞 RNA 快速提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含基因組去除劑)、化學(xué)修飾熱啟動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(山東思科捷科學(xué)儀器有限公司)；HIF-1α試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)；PHD-2試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)；帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司，YZ24)；眼科A超(法國(guó)Quantel Medical公司)；針灸針、電子診療儀[醫(yī)療用品廠有限公司(蘇州)，華佗牌SDZ-V型]。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組90只豚鼠隨機(jī)均分為3組，每組30只，即正常對(duì)照(NC)組、透鏡誘導(dǎo)型近視(LIM)組、電針+透鏡誘導(dǎo)型近視(LIM+EA)組。NC組豚鼠正常飼養(yǎng)，不干預(yù)；LIM組和LIM+EA組豚鼠右眼配戴-6.0 D透鏡片，建立近視模型；LIM+EA組豚鼠戴鏡同時(shí)給予雙側(cè)針刺合谷穴和太陽穴，每天上午9點(diǎn)開始電針干預(yù)30 min。各組豚鼠每天早晚巡視2遍，及時(shí)發(fā)現(xiàn)脫落及臟的鏡片，清洗干凈后立即戴上，左眼作為自身對(duì)照不干預(yù)。電針參數(shù)：波形為連續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度2 mA，脈沖長(zhǎng)度0.1 s。

1.2.2 各組豚鼠屈光度及眼軸長(zhǎng)度的測(cè)量各組豚鼠造模后2 周、4 周采用帶狀光檢影進(jìn)行屈光度檢查。檢查前結(jié)膜囊內(nèi)滴10 g·L-1鹽酸環(huán)噴托酯散瞳液3次，每次1滴，間隔10 min，滴眼30 min后由驗(yàn)光師在暗室中使用帶狀光檢影，工作距離為50 cm。屈光度為垂直和水平兩條主子午線檢驗(yàn)的平均值。

造模后2 周、4 周各組豚鼠采用A超進(jìn)行眼軸長(zhǎng)度測(cè)量，檢查前用4 g·L-1鹽酸奧布卡因眼液滴眼進(jìn)行表面麻醉。儀器參數(shù)設(shè)置為[8]：前房傳播速度1557 m·s-1，玻璃體傳播速度1540 m·s-1，晶狀體傳播速度1723 m·s-1。測(cè)量時(shí)探頭垂直角膜平面，且盡可能對(duì)準(zhǔn)瞳孔中心，不壓迫角膜，取圖形較穩(wěn)定、清晰且晶狀體后囊膜和視網(wǎng)膜雙峰均高于基線為確定圖像，每眼重復(fù)測(cè)量10次,取平均值。整個(gè)過程均由同一技師操作完成。

1.2.3 各組豚鼠鞏膜中HIF-1α和PHD-2的mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)造模后2周和4周每組隨機(jī)選取6只豚鼠，麻醉致死后取出右眼眼球，沿角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體等眼前節(jié)組織，剝離出玻璃體，去除視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜，獲取后極部鞏膜組織。用組織/細(xì)胞 RNA 快速提取試劑盒提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用q-PCR技術(shù)檢測(cè)各組豚鼠鞏膜中HIF-1α和PHD-2 的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參基因。利用 DNAStar軟件設(shè)計(jì)各引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。HIF-1α上游引物:5’-AGCACAACTACAGCATTCCAGCAG-3’,下游引物：5’-GGTGGTGATGTTGTGGCACGAG-3’，大小為200 bp；PHD-2上游引物:5’-CTTGCGGGAGGGTTTTGGTGGTC-3’，下游引物：5’-CCCTCCCCTTCTGCCTCTTGGTTC-3’，大小為219 bp；GAPDH 上游引物:5’-CTGACCTGCCGCCTGGAGA-AACC-3’，下游引物:5 ’-ATGCCAGCCCCAGCGTCA-AAAGT-3’，大小為170 bp。采 用 2-△△Ct方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，將NC組目的基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)置為1。

1.2.4 各組豚鼠鞏膜中HIF-1α和PHD-2的蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)造模后2周和4周，每組取6只豚鼠右眼鞏膜組織，液氮研磨，按質(zhì)量體積比(20 mg200 μL)加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀法緩沖液裂解液(RIPA)，充分勻漿直至裂解完全，14 000 r·min-1離心4 min，取上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書檢測(cè)各組豚鼠鞏膜中HIF-1α和PHD-2的蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 電鏡觀察各組豚鼠鞏膜膠原纖維直徑大小各組于造模后4周每組隨機(jī)選取3只豚鼠，按8 mL·kg-1體質(zhì)量腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉，過量麻醉處死后摘取右眼眼球立即置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中固定。2 h后取出眼球，將后極部眼球壁切成<1 mm條狀大小置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中固定，體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸行后固定，各級(jí)酒精及丙酮脫水，浸透包埋，固化，超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。由同一技師使用Image J軟件對(duì)各組豚鼠鞏膜膠原纖維直徑進(jìn)行測(cè)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。造模后各組豚鼠間屈光度、眼軸長(zhǎng)度、鞏膜膠原纖維直徑及HIF-1α和PHD-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平比較采用多重比較LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠屈光度、A超測(cè)量參數(shù)比較造模前，NC組、LIM組和LIM+LA組豚鼠右眼屈光度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后2周和4周，與NC組豚鼠右眼屈光度相比，LIM組和LIM+EA組豚鼠右眼近視屈光度均明顯增加(均為P<0.001)。與LIM組相比，LIM+EA組豚鼠右眼近視屈光度均減小(P2周<0.01、P4周<0.001)(見表1)。

造模后2周和4周，與NC組相比，LIM組和LIM+EA組晶狀體厚度均增加，除LIM+EA組造模后2周晶狀體厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。造模后2周和4周，與NC組相比，LIM組和LIM+EA組玻璃體腔深度增加(均為P<0.01)；LIM組和LIM+EA組眼軸均延長(zhǎng)(均為P<0.001)。與LIM組相比，LIM+EA組前房深度、晶狀體厚度和玻璃體腔深度均下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，眼軸長(zhǎng)度變短(P<0.05)。造模前及造模后2周、4周，三組豚鼠前房深度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表2)。

表1 造模前及造模后2周和4周3組豚鼠屈光度

表2 造模前及造模后2周和4周3組豚鼠A超測(cè)量參數(shù)比較

2.2 各組豚鼠鞏膜中HIF-1α和PHD-2的mRNA表達(dá)水平的比較造模后2周和4周，LIM組豚鼠右眼鞏膜中HIF-1α mRNA表達(dá)水平與NC組和LIM+EA組相比均明顯升高(均為P<0.05)，而NC組豚鼠右眼鞏膜中HIF-1α mRNA表達(dá)水平與LIM+EA組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表3)。

造模后2周和4周，LIM組豚鼠右眼鞏膜中PHD-2 mRNA表達(dá)水平與NC組和LIM+EA組相比均明顯降低(均為P<0.05)，而NC組豚鼠右眼鞏膜中PHD-2 mRNA表達(dá)水平與LIM+EA組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表3)。

2.3 各組豚鼠鞏膜中HIF-1α和PHD-2的蛋白表達(dá)水平的比較造模后2周和4周，LIM組豚鼠右眼鞏膜中HIF-1α蛋白表達(dá)水平與NC組和LIM+EA組相比均明顯升高(均為P<0.05)，而NC組右眼鞏膜中HIF-1α蛋白表達(dá)水平與LIM+EA組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。造模后2周和4周，LIM組右眼鞏膜中PHD-2蛋白表達(dá)水平與NC組和LIM+EA組相比均明顯降低(均為P<0.05)，而NC組豚鼠右眼鞏膜中PHD-2蛋白表達(dá)水平與LIM+EA組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表3)。

2.4 各組豚鼠鞏膜電鏡觀察結(jié)果造模后4周，各組豚鼠鞏膜電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著屈光度的增加，鞏膜膠原纖維越稀疏、直徑越小。與NC組豚鼠鞏膜膠原纖維直徑[(82.94±26.03)nm]相比，LIM組[(48.90±23.38)nm]和LIM+EA組[(62.83±21.72)nm]豚鼠鞏膜膠原纖維直徑均變小(均為P<0.001)。與LIM組相比，LIM+EA組膠原纖維直徑變大(P<0.001)(見圖1)。

表3 造模后2周和4周各組豚鼠鞏膜HIF-1α和PHD-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

圖1 造模后4周各組豚鼠鞏膜電鏡觀察結(jié)果

3 討論

由于豚鼠的屈光狀態(tài)、正視化機(jī)制與人類相似，常用于制作近視模型，并且豚鼠LIM模型已廣泛應(yīng)用于近視的實(shí)驗(yàn)研究。目前，對(duì)于近視發(fā)病機(jī)制的研究主要認(rèn)為是通過視網(wǎng)膜-視網(wǎng)膜色素上皮層-脈絡(luò)膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)啟動(dòng)作用到鞏膜重塑的信號(hào)，導(dǎo)致鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑，鞏膜進(jìn)行性變薄，眼軸長(zhǎng)度變長(zhǎng)，最終導(dǎo)致近視的發(fā)展[2，9]。豚鼠等哺乳動(dòng)物的鞏膜主要由膠原纖維、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。本研究發(fā)現(xiàn)，在近視發(fā)展過程中，LIM組豚鼠鞏膜膠原纖維直徑變小，與以往研究結(jié)果一致[10]；并且，在電針干預(yù)后，LIM+LA組豚鼠鞏膜膠原纖維直徑較LIM組變大。表明電針可以改善鞏膜膠原纖維降解影響近視的發(fā)生發(fā)展。

近年來研究表明，在近視發(fā)展過程中[3-4],HIF-α表達(dá)升高導(dǎo)致鞏膜缺氧，參與近視的發(fā)生發(fā)展。而在玻璃體內(nèi)注射抗缺氧藥物后可以上調(diào)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而有效改善鞏膜缺氧，抑制近視的發(fā)生發(fā)展[3]，表明改善鞏膜缺氧是延緩近視的有效治療方法。HIF-1α在常氧狀態(tài)下經(jīng)PHD羥化后，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)迅速降解；而在缺氧狀態(tài)下,PHD活性下降，HIF-1α降解減少導(dǎo)致其大量積聚，從而誘導(dǎo)機(jī)體缺氧反應(yīng)[11]。PHD作為氧感受器，是降解HIF-α的關(guān)鍵酶。PHDs分為PHD-1、PHD-2和PHD-3，其中PHD-2活性強(qiáng)度最高[12]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，在近視發(fā)展過程中，隨著HIF-1α表達(dá)水平升高，PHD-2含量下降，造成鞏膜缺氧。

目前對(duì)于近視的治療手段多樣，但仍缺乏治療效果可靠、副作用小的治療手段。而近年來，針灸作為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用于治療近視取得了一定的成效，已證實(shí)可以改善近視的發(fā)生發(fā)展[9，13-15]。袁野[16]研究發(fā)現(xiàn)，通過眼三針配合耳穴及眼眶外經(jīng)穴配合耳穴治療青少年近視，可改善患者視物干澀、酸脹等不適癥狀及延緩近視的發(fā)展。王晶等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)輕中度近視青少年給予電針加體針治療，近視顯著改善，而眼軸長(zhǎng)度沒有明顯影響[18]。但是吳姍姍等[15]在透鏡誘導(dǎo)型近視豚鼠中發(fā)現(xiàn)，電針不僅改善了近視，也延緩了眼軸的發(fā)展。表明電針在治療近視方面確實(shí)發(fā)揮著一定的作用，但是其具體機(jī)制并不明確。電針作為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，可使眼周血管平滑肌緊張度降低，血管痙攣解除，管腔通暢，血流速度加快，改善局部神經(jīng)、肌肉的血液供應(yīng)，消除缺血和缺氧狀態(tài)[14]，有研究也證明電針干預(yù)可以上調(diào)HIF-1α表達(dá)[5]。因此，我們猜測(cè)電針干預(yù)可通過改善眼部血液微循環(huán)以改善鞏膜缺氧，進(jìn)而延緩近視發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果也證實(shí)了，電針干預(yù)可以通過上調(diào)PHD-2含量來抑制HIF-1α表達(dá)，從而改善鞏膜缺氧以延緩近視發(fā)生發(fā)展，然而，電針干預(yù)改善鞏膜缺氧的具體信號(hào)分子及其具體機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步探索其可能的分子機(jī)制，為研究近視發(fā)生發(fā)展過程中鞏膜的作用提供有效的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。