李璐 劉玨君 許阿敏 陳長(zhǎng)征 Nicole ETER

脈絡(luò)膜新生血管(CNV)的形成是導(dǎo)致許多眼底病患者視力急劇下降的最主要原因。目前，抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)藥物是治療CNV的一線方案。但部分患者對(duì)抗VEGF藥物呈無(wú)應(yīng)答反應(yīng)。因此，繼續(xù)探索其他可能抑制或改善CNV的途徑依然是亟待解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。已有研究證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞在CNV的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1-2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，激光誘導(dǎo)小鼠CNV形成后，激光斑附近可見(jiàn)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞聚集[3]，并可分泌大量促血管生成物質(zhì)及炎癥因子[4]，但具體機(jī)制尚未完全明確。

小膠質(zhì)細(xì)胞作用的發(fā)揮與其表面多種受體存在緊密關(guān)系[2]。已有研究證實(shí)，嘌呤受體(P2)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞功能發(fā)揮中起至關(guān)重要的作用[5]。但在視網(wǎng)膜內(nèi)，P2受體是否同樣影響小膠質(zhì)細(xì)胞的功能并影響CNV的形成，相關(guān)報(bào)道尚少。因此，本研究通過(guò)激光誘導(dǎo)建立小鼠CNV模型，檢測(cè)局部激活小膠質(zhì)細(xì)胞的P2受體表達(dá)情況，并通過(guò)抑制P2受體觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活性的改變及對(duì)CNV發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇健康清潔級(jí)6～8周C57BL/6J小鼠25只(體質(zhì)量為18～23 g)，與C57BL/6J小鼠逆代雜交至少10次的CX3CR1GFP/+基因敲除小鼠15只(德國(guó)明斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)。所有小鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障系統(tǒng)。動(dòng)物的飼養(yǎng)與處死遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南》。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，同時(shí)獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院及德國(guó)明斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器CD11b抗體(MCA711，英國(guó)Serotec公司)，P2受體特異性抑制劑磷酸吡哆醛-6-偶氮(苯-2，4-二磺酸)四鈉鹽水合物(PPADS，sc-202770A)、P2X4抗體(sc-15187)、P2X7抗體(sc-15200)、P2Y2抗體(sc-20124)、P2Y12抗體(sc-27152)(美國(guó)Santa Cruz公司)。熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，共聚焦激光眼底熒光造影儀(德國(guó)海德堡公司)，多激光治療儀(中國(guó)科林儀器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立除正常對(duì)照組(5只C57BL/6J小鼠)外，其余小鼠(包括C57BL/6J小鼠和CX3CR1GFP/+小鼠)均建立激光誘導(dǎo)CNV建立動(dòng)物模型。具體步驟參考文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 動(dòng)物分組及干預(yù)25只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為5組，以非激光組作為正常對(duì)照組(5只)，剩余小鼠(模型組)在激光后第1天、第4天、第7天及第14天麻醉后處死并摘除眼球，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只。15只CX3CR1GFP/+小鼠隨機(jī)分為3組，每組各5只，第1組和第2組在造模成功后即在玻璃體內(nèi)分別注射2 μL PPADS(PPADS注射組)或PBS(PBS對(duì)照組)，第3組在造模成功后每天一次PPADS局部滴眼(PPADS眼藥組)，共3 d。以玻璃體內(nèi)注射PBS作為PBS對(duì)照組。造模后第4天，CX3CR1GFP/+小鼠先于麻醉散瞳狀態(tài)下行視網(wǎng)膜自發(fā)熒光檢測(cè)和熒光素眼底血管造影(FFA)檢查，之后處死取眼球進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 視網(wǎng)膜自發(fā)熒光檢測(cè)和FFA檢查麻醉并散瞳后，采用德國(guó)海德堡2代視網(wǎng)膜血管顯像儀對(duì)3組CX3CR1GFP/+小鼠視網(wǎng)膜行自發(fā)熒光檢測(cè)和FFA檢查。在自發(fā)熒光模式下采集小鼠視網(wǎng)膜圖像后將0.2 mL 10 g·L-1熒光素鈉注射液注入小鼠腹腔，注射開(kāi)始計(jì)時(shí)行FFA檢查雙眼并于1 s內(nèi)注射完成。使用30°攝像鏡頭對(duì)準(zhǔn)視盤(pán)及周?chē)鷧^(qū)域獲取后極部視網(wǎng)膜圖像。為了提高熒光信號(hào)的信噪比，使用圖像分析軟件(Heidelberg Eye Explorer,Heidelberg Engineering)從多幅圖像中計(jì)算出一幅均值圖像。

1.2.4 視網(wǎng)膜冰凍切片及免疫熒光化學(xué)染色具體步驟參考文獻(xiàn)[4]，將染色后組織切片置于倒置熒光顯微鏡下照像并保存。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜中P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受體mRNA含量的變化。依照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取mRNA，使用Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用PCR儀進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。引物序列如下：P2X4上游引物：5’-TGTCCCCAGGCTACAATTTC-3’，下游引物：5’-GGCAGCTTTTTCTCCCTTCT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度373 bp；P2X7上游引物：5’-CTTTTGCACCTTGAGCTTCC-3’，下游引物：5’- TCCATGCTAAGGGATTCTGG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度152 bp；P2Y2上游引物：5’-GTGGCCTACAGCTTGGTCAT-3’，下游引物：5’-GCGTGCGGAAGGAGTAGTAG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度235 bp；P2Y12上游引物：5’-AGTGATGCCAAACTGGGAAC-3’，下游引物：5’-TGAATGCCCAGATAACCACA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度208 bp。mRNA的相對(duì)表達(dá)量使用公式2-ΔΔCt×103計(jì)算。將對(duì)照組目的基因的相對(duì)表達(dá)量作為1，各標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次后取其平均值。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析采用Adobe Photoshop CS5 (Adobe,San Jose,CA)軟件對(duì)自發(fā)熒光圖像中激光斑處小膠質(zhì)細(xì)胞熒光像素強(qiáng)度及FFA圖像中CNV處熒光滲漏像素強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。分別通過(guò)比較激光斑處小膠質(zhì)細(xì)胞熒光像素強(qiáng)度或CNV處熒光滲漏像素強(qiáng)度與周邊正常視網(wǎng)膜處像素強(qiáng)度，計(jì)算熒光比，以減少由于不同采集時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度差異造成的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差不齊時(shí)采用近似F檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 激光誘導(dǎo)CNV形成后視網(wǎng)膜P2受體的表達(dá)

2.1.1 免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常視網(wǎng)膜(正常對(duì)照組)中靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞幾乎無(wú)P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受體表達(dá)，但激光誘導(dǎo)CNV形成后，激光斑附近可見(jiàn)大量目標(biāo)受體表達(dá)，部分熒光與激活的小膠質(zhì)細(xì)胞熒光融合。與正常對(duì)照組相比，模型組四種目標(biāo)受體表達(dá)量在激光損傷后第1天即可增加；第4天達(dá)峰值；隨后下降，第7天時(shí)少量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)受體；第14天時(shí)，僅有極少量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)受體(圖1)。

結(jié)合本工程強(qiáng)蝕變巖的物理力學(xué)特性、注漿模擬試驗(yàn)成果及工程實(shí)踐，總結(jié)出了一套適合于強(qiáng)蝕變巖TBM洞段的施工方法，其處理工藝流程見(jiàn)圖7。主要步驟如下：

2.1.2 激光誘導(dǎo)CNV形成后目標(biāo)受體mRNA的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，激光誘導(dǎo)CNV形成后，與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠四種受體P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12的mRNA在激光損傷后第1天即顯著增加，第4天時(shí)達(dá)峰值(t=6.05、2.95、3.67、5.98,均為P<0.01)，隨后(第7天)漸下降;但在第14天時(shí)小幅度增加。與第7天模型組小鼠目標(biāo)受體P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12的mRNA含量相比，第14天時(shí)目標(biāo)受體mRNA含量小幅度的增量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.59、11.32、9.41、6.97,P=0.057、0.061、0.064、0.072)(圖2)。

2.2 PPADS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和P2受體的抑制作用

2.2.1 PBS對(duì)照組、PPADS眼藥組和PPADS注射組視網(wǎng)膜免疫熒光化學(xué)染色免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，PPADS眼藥組和PPADS注射組小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受體含量均明顯少于PBS對(duì)照組(圖3)。

2.2.2 PBS對(duì)照組、PPADS眼藥組及PPADS注射組目標(biāo)受體mRNA的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，PPADS注射組(t=5.54、9.82、3.86、7.91；均為P<0.01)和PPADS眼藥組(t=3.24、5.89、6.75、4.97；均為P<0.01)P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受體mRNA的含量均明顯下降，而PPADS眼藥組與PPADS注射組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.82、12.32、10.13、8.79,P=0.876、0.793、0.574、0.497)(圖4)。

圖1 激光誘導(dǎo)CNV形成后不同時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞(CD11b綠色，左圖)P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y12受體(紅色，右圖)的表達(dá) GCL：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層。

圖2 激光誘導(dǎo)CNV形成后不同時(shí)間點(diǎn)P2受體mRNA表達(dá)水平

圖3 激光誘導(dǎo)CNV形成后第4天PBS對(duì)照組、PPADS眼藥組和PPADS注射組小膠質(zhì)細(xì)胞(CD11b綠色，左圖)P2受體(紅色，右圖)的表達(dá) GCL：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層。

圖4 激光誘導(dǎo)CNV形成后第4天PPADS眼藥組、PPADS注射組和PBS對(duì)照組P2受體mRNA表達(dá)水平

2.2.3 PBS對(duì)照組、PPADS眼藥組及PPADS注射組視網(wǎng)膜自發(fā)熒光檢測(cè)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞自發(fā)熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組、PPADS注射組、PPADS眼藥組熒光比分別為4.54±1.22、1.99±0.62、2.74±0.84。與PBS對(duì)照組相比，PPADS眼藥組與PPADS注射組的小膠質(zhì)細(xì)胞自發(fā)熒光強(qiáng)度均明顯減弱(均為P<0.001)；PPADS注射組與PPADS眼藥組相比，PPADS注射組小膠質(zhì)細(xì)胞的自發(fā)熒光強(qiáng)度降低更為顯著(P<0.001)(圖5)。

2.2.4 PBS對(duì)照組、PPADS眼藥組及PPADS注射組視網(wǎng)膜FFA檢查結(jié)果FFA檢查結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組、PPADS注射組、PPADS眼藥組CNV滲漏熒光比為分別2.38±1.35、1.55±0.54、1.45±0.72。與PBS對(duì)照組相比，PPADS眼藥組與PPADS注射組的CNV熒光滲漏強(qiáng)度均明顯減弱(均為P<0.001)；但PPADS眼藥組與PPADS注射組之間，CNV熒光滲漏強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.864)(圖6)。

圖5 PBS對(duì)照組(A)、PPADS眼藥組(B)及PPADS注射組(C)內(nèi)小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞自發(fā)熒光以及三組間小膠質(zhì)細(xì)胞自發(fā)熒光的熒光比差異(D)

圖6 PBS對(duì)照組(A)、PPADS眼藥組(B)及PPADS注射組(C)內(nèi)小鼠視網(wǎng)膜FFA顯示CNV處熒光滲漏以及三組間CNV熒光比差異(D)

3 討論

P2X4和P2X7受體已被證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞并加強(qiáng)突觸生理功能，調(diào)節(jié)免疫并協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)[8-9]，但在眼部，是否參與視網(wǎng)膜疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究尚少。Gu等[10]研究顯示，在AMD患者中，P2X4 Tyr315Cys的基因變異率較同年齡正常對(duì)照組高2倍以上，P2X7 Gly150Arg的基因變異率也遠(yuǎn)超正常對(duì)照組。在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物眼部，正常情況下，P2X4和P2X7受體可作為視網(wǎng)膜中的清道夫受體，清除視網(wǎng)膜下的代謝沉積物，一旦被異常激活，它們會(huì)引起生理性吞噬功能的喪失，使個(gè)體增加罹患AMD的風(fēng)險(xiǎn)[10]。P2Y2和P2Y12是否參與CNV的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，相關(guān)報(bào)道尚少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠視網(wǎng)膜中，幾乎無(wú)激活的P2受體(P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12)表達(dá)，但在激光誘導(dǎo)CNV形成后，P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12四種受體均可激活，在CNV形成后第1天，四種受體含量即可明顯增加，至第4天時(shí)達(dá)峰值，隨后漸下降，且在激光損傷后早期(第1天和第4天)，大量P2受體(尤其是P2X4、P2X7和P2Y12)的熒光與小膠質(zhì)細(xì)胞熒光重合，提示CNV處激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)P2受體。激光誘導(dǎo)CNV形成后期(第14天)，目標(biāo)受體含量的下降也可能與表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞激活量的下降有關(guān)[4]。

PPADS是P2受體特異性拮抗劑[11]。Birke等[12]研究結(jié)果顯示，在激光誘導(dǎo)CNV形成小鼠模型中，連續(xù)3 d PPADS滴眼可縮小CNV滲漏范圍，并減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。他們認(rèn)為該治療作用是因?yàn)镻PADS可抑制補(bǔ)體的激活以及膜攻擊復(fù)合物的形成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)兩種不同方式(玻璃體內(nèi)注射和局部滴眼)，PPADS均可顯著減少激光斑附近激活小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和激光誘導(dǎo)生成的CNV的熒光滲漏。我們認(rèn)為，其可能原因?yàn)镻PADS可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞表面的P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受體從而影響小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，進(jìn)一步影響小膠質(zhì)細(xì)胞在CNV發(fā)生發(fā)展中的作用[2，4]，減少CNV的滲漏。

本研究中PPADS注射組和PPADS眼藥組采用玻璃體內(nèi)注射和局部滴眼兩種干預(yù)方式，抑制結(jié)果評(píng)價(jià)以PPADS注射組為主。初步探索PPADS局部滴眼方式也可達(dá)到抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性和CNV滲漏的效果，但抑制效果不及玻璃體內(nèi)注射方式。后續(xù)仍需進(jìn)一步參考藥物通透性設(shè)置不同藥物濃度組以及對(duì)照組，研究不同干預(yù)方式的具體抑制效果差異，為無(wú)創(chuàng)性治療方式提供可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究采用CD11b作為小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，雖然CD11b除小膠質(zhì)細(xì)胞外，同時(shí)可不同程度地標(biāo)記巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞，但我們前期研究已證實(shí)，在激光誘導(dǎo)小鼠CNV形成模型中，激光斑附近激活聚集的CD11b+細(xì)胞以小膠質(zhì)細(xì)胞為主[3]。本研究初步證實(shí)了激光誘導(dǎo)CNV形成后，小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受體，且表達(dá)量在激光損傷后第4天達(dá)最大值。P2受體抑制劑PPADS在抑制P2受體后，可進(jìn)一步影響小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，同時(shí)減少CNV的滲漏。但本研究仍有以下缺陷：(1)激光誘導(dǎo)CNV模型僅是模擬臨床急性損傷導(dǎo)致CNV形成模型的一種，不能完全比擬臨床上其他原因，如慢性缺血缺氧等，導(dǎo)致CNV形成的過(guò)程，因此以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論是否在其他CNV模型中同樣成立有待進(jìn)一步研究。(2)該實(shí)驗(yàn)尚未深入探討PPADS對(duì)CNV抑制作用的具體機(jī)制，P2受體及其抑制劑是通過(guò)何種信號(hào)通路影響CNV的發(fā)生發(fā)展，且PPADS能否成為臨床防治CNV的新方向，將是我們繼續(xù)研究的重點(diǎn)。