胡偉男 蔡文婷 鄒愛(ài)琪 朱美江 劉暢 于靖

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是導(dǎo)致老年人不可逆性視力喪失的主要原因之一[1],據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界約有2100萬(wàn)AMD患者[2]。大多數(shù)嚴(yán)重視力喪失的患者是滲出型AMD，其特征是脈絡(luò)膜新生血管(CNV)生長(zhǎng)到視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)下間隙[3]。CNV主要由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)驅(qū)動(dòng)[4]。目前臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)方法為玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物[5]。然而，反復(fù)進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射存在發(fā)生眼內(nèi)炎、高眼壓等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，一旦發(fā)生將導(dǎo)致嚴(yán)重的視力下降[6]。因此，尋找一種安全可靠的給藥方式是當(dāng)務(wù)之急。聚乙二醇(PEG)具有良好的溶解性及親水性，且無(wú)毒、無(wú)免疫原性、易化學(xué)修飾，可進(jìn)行多官能團(tuán)修飾，是一種很有前途的納米載體，可用于治療性藥物傳遞、基因傳遞及CT/MR成像[7]。本研究首先合成了PEG星型高分子(S-PPEGMA10，S-PEG)聚合物作為載體，然后用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)和吲哚菁綠(ICG)對(duì)其進(jìn)行修飾，并負(fù)載抗VEGF藥物雷珠單抗(RBZ)，形成納米粒子S-PEG-ICG-RGD-RBZ NPs(SPIRR NPs)用于CNV的治療，為尋求新的給藥方式提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性C57BL/6小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)106只，6～8周齡,體質(zhì)量25～30 g。所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照視力和眼科協(xié)的聲明《視力與眼科動(dòng)物研究使用說(shuō)明》和上海市第十人民醫(yī)院《動(dòng)物研究使用指南》的規(guī)定進(jìn)行護(hù)理和使用，并嚴(yán)格遵守國(guó)家衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物護(hù)理和使用制定的相關(guān)指南。

1.2 主要試劑和儀器PEG甲基丙烯酸酯[PEGMA(Mn=300)]、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；ICG-NH2(美國(guó)AAT Bioquest公司)；人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(上海中喬新舟生物科技有限公司)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(ECM)和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑(ECGs)(美國(guó)ScienCell公司)；胎牛血清(FBS)(美國(guó)HyClone公司)；CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；40 g·L-1多聚甲醛(武漢谷歌生物科技有限公司)；戊巴比妥鈉(上海博蘊(yùn)生物科技有限公司)；鹽酸丙美卡因滴眼液(美國(guó)愛(ài)爾康公司)；鉀(K+)、氯(Cl-)、鈣(Ca2+)離子試劑盒(南京建成研究所)。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer公司)；納米粒度和電位分析儀(英國(guó)Malvern儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 SPIRR NPs納米粒子的合成與表征檢測(cè)

1.3.1.1 SPIRR NPs的合成以PEGMA為原料，在二惡烷中進(jìn)行RAFT聚合，合成L-PEG，再采用RAFT分散聚合法在水/乙醇溶液中合成S-PEG，將熒光基團(tuán)ICG與S-PEG結(jié)合得到S-PEG-ICG。稱取0.18 g S-PEG-IGC溶解在2 mL MES緩沖液中，加入30 mg NHS和50 mg EDC攪拌30 min，加入10 mg RGD和11.5 mg RBZ繼續(xù)反應(yīng)2 d，然后在水相中透析(MWCO=3000)3 d，得到的澄清透明溶液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后，冷凍干燥得到最終產(chǎn)物SPIRR NPs。

1.3.1.2 表征檢測(cè)(1)水合粒徑：分別稱取S-PEG和SPIRR NPs粉末各1.0 mg溶解在超純水中，采用Nano-ZS型納米粒度分析儀測(cè)試納米材料的水合粒徑；(2)Zeta表面電勢(shì)：分別稱取制備得到并純化后的S-PEG、S-PEG-ICG和SPIRR NPs粉末各1.0 mg溶解在超純水中，采用Zeta電位分析儀測(cè)試納米材料的表面電勢(shì)；(3)紫外吸收光譜：將制備得到并純化后的S-PEG、S-PEG-ICG和SPIRR NPs粉末各1.0 mg溶解在超純水中，測(cè)試紫外吸收光譜，掃描范圍為200～1000 nm。

1.3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 細(xì)胞水平SPIRR NPs生物安全性的驗(yàn)證將ARPE-19細(xì)胞以每孔5000個(gè)的密度接種于96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)使其貼壁生長(zhǎng)。第2天移除上清液后在每孔中加入不同濃度(0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)的SPIRR NPs，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后移除上清液，再于每孔中加入10 μL CCK-8溶液和100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量各孔吸光度(D)值。

1.3.2.2 SPIRR NPs對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC管腔形成的影響將培養(yǎng)的HUVEC分為四組，分別為正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)細(xì)胞；VEGF干預(yù)組：向培養(yǎng)的HUVEC中加入20 μmol·L-1VEGF進(jìn)行干預(yù)；低濃度治療組：向培養(yǎng)的HUVEC中加入20 μmol·L-1VEGF 進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)加入50 μmol·L-1SPIRR NPs進(jìn)行治療；高濃度治療組：向培養(yǎng)的HUVEC中加入20 μmol·L-1VEGF 進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)加入100 μmol·L-1SPIRR NPs進(jìn)行治療。將細(xì)胞以每孔300×103個(gè)接種于6孔板中，按照上述分組處理后培養(yǎng)24 h。將干預(yù)后的各組細(xì)胞重懸，按照每孔5×103個(gè)加入固化了35 μL Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中，放入培養(yǎng)箱中孵育6 h后取出，在倒置顯微鏡下拍照，最后利用Image J軟件分別計(jì)算管腔節(jié)數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、節(jié)段數(shù)和相對(duì)管腔長(zhǎng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型的建立小鼠均選右眼造模。小鼠腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉后，應(yīng)用5 g·L-1復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，暴露右眼，使用滴加氧氟沙星眼膏的載玻片作為接觸鏡，于激光機(jī)下進(jìn)行造模。采用532 nm的激光光凝，激光強(qiáng)度150 mW，持續(xù)時(shí)間0.05 s，光斑大小50 μm。光凝位置為距視盤等距離的2支視網(wǎng)膜血管間，光凝4～6個(gè)點(diǎn)，光凝后出現(xiàn)氣泡或輕度出血視為造模成功。

1.3.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將小鼠分為5組，分別為對(duì)照組(n=26)：正常C57BL/6小鼠；PBS組(n=20)：激光光凝7 d后，尾靜脈注射50 μL 1×PBS；S-PEG組(n=20)：激光光凝7 d后，尾靜脈注射50 μL S-PEG；SPIRR組(n=26)：激光光凝7 d后，尾靜脈注射50 μL 1 g·L-1SPIRR NPs；RBZ組(n=20)：激光光凝7 d后，玻璃體內(nèi)注射1 μL 10 g·L-1RBZ。

1.3.3.3 眼底照相與FFA檢查激光造模后按照上述分組對(duì)小鼠進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)后28 d，使用10 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉小鼠，復(fù)方托吡卡胺散瞳，對(duì)各組小鼠進(jìn)行眼底照相，再于腹腔內(nèi)注射 0.2 mL 10 g·L-1熒光素鈉進(jìn)行FFA檢查，并采集圖像。

1.3.3.4 眼底ICGASPIRR組小組激光光凝后7 d，于鼠尾靜脈注射SPIRR NPs，并于激光光凝后0 d、7 d、14 d、28 d、90 d，采用1.3.3.3方法對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉散瞳后，使用造影機(jī)ICGA模式進(jìn)行照相采集。

1.3.3.5 CNV面積的測(cè)量除SPIRR組保留6只小鼠觀察外，其余各組小鼠均于干預(yù)后28 d使用10 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉后，暴露心臟，于右心房處剪一小口，從左心室快速推注20 mL 1×PBS溶液，再注入0.2 mL FITC-dextran溶液(25 g·L-1)，見(jiàn)小鼠四肢、尾巴出現(xiàn)黃染后，推注20 mL 40 g·L-1多聚甲醛進(jìn)行固定。隨后摘取眼球，在角鞏膜緣處扎一小孔，浸入FSA眼球固定液中固定2 h，完成后于顯微鏡下去除除RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜外所有組織，并以視盤為中心分為大致相等的4個(gè)象限，視網(wǎng)膜部分朝上。IB4抗體(11000)染色30 min。隨后用1×PBS漂洗3次，置于干凈的載玻片上，滴加抗淬滅劑后封片，將載玻片放在熒光顯微鏡下觀察，記錄鋪片上的CNV病灶。CNV面積用Image J軟件測(cè)量。

1.3.3.6 動(dòng)物水平SPIRR NPs生物安全性的驗(yàn)證小鼠按上述分組干預(yù)28 d摘取眼球時(shí)，于傷口處采集血樣。血清以4600 r·min-1離心10 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂媚暇┙ǔ缮锕こ萄芯克谑凵虡I(yè)試劑盒檢測(cè)以下指標(biāo)：(1)肝功能：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)；(2)腎功能：肌酐(Cr)；(3)血脂：總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)；(4)電解質(zhì)：K+、Ca2+、Cl-。

1.3.4 溶血試驗(yàn)在上海市第十人民醫(yī)院招募健康成人志愿者10人，于空腹8 h后采集靜脈血，加生理鹽水離心，棄上清，重復(fù)操作至上清液無(wú)色，棄上清，將底部沉淀的紅細(xì)胞用生理鹽水重懸成體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸液。分別在2 mL 1.25～10.00 g·L-1SPIRR NPs、生理鹽水(陰性對(duì)照)及ddH2O(陽(yáng)性對(duì)照)中加入2 mL紅細(xì)胞懸液，37 ℃下混勻孵育30 min。離心機(jī)3000 r·min-1離心5 min，收集上清液。酶標(biāo)儀540 nm下測(cè)定各組D值，并按照公式計(jì)算溶血率：溶血率=(D試驗(yàn)組-D陰性對(duì)照組)/(D陽(yáng)性對(duì)照組-D陰性對(duì)照組)×100%。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件和GraphPad Prism Version 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SPIRR NPs的表征檢測(cè)由于粒子簇的形成，SPIRR NPs納米粒子表現(xiàn)出比S-PEG大得多的流體力學(xué)尺寸。S-PEG、S-PEG-ICG和SPIRR NPs的Zeta電勢(shì)分別為(-4.74±1.56)mV、(-3.79±0.47)mV和(-2.42±0.13)mV?；赨V-Vis光譜，ICG單元成功偶聯(lián)到S-PEG表面，S-PEG-ICG和SPIRR NPs納米粒子的表面等離子體共振峰幾乎沒(méi)有明顯差異(圖1)。

圖1 各材料表征實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 A：S-PEG的平均粒徑；B： SPIRR NPs的平均粒徑；C：各材料的Zeta電勢(shì)；D：各材料的紫外-可見(jiàn)光譜。

2.2 SPIRR NPs對(duì)細(xì)胞活性的影響CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1的SPIRR NPs處理ARPE-19細(xì)胞24 h后,細(xì)胞存活率分別為0.89±0.01、0.87±0.05、0.85±0.04、0.89±0.07、0.89±0.07、0.85±0.04,各濃度組細(xì)胞存活率間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.3 SPIRR NPs對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC管腔形成的影響管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，當(dāng)給予SPIRR NPs干預(yù)后，VEGF誘導(dǎo)的管腔形成被有效抑制。計(jì)算各組的管腔節(jié)數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、節(jié)段數(shù)及相對(duì)管腔長(zhǎng)度結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、VEGF干預(yù)組、低濃度治療組、高濃度治療組管腔節(jié)數(shù)分別為55.00±16.00、110.00±13.00、44.67±14.36及25.33±17.00，管腔節(jié)點(diǎn)數(shù)分別為16.00±4.58、31.67±5.51、12.67±5.03及8.00±5.20，管腔節(jié)段數(shù)分別為20.67±7.37、45.33±8.08、14.33±6.03及7.67±6.66，相對(duì)管腔長(zhǎng)度分別為1.00±0.00、1.51±0.08、0.97±0.18及0.75±0.15。與正常對(duì)照組相比，VEGF干預(yù)組管腔節(jié)數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、節(jié)段數(shù)以及相對(duì)管腔長(zhǎng)度均有大幅度增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與VEGF干預(yù)組相比，低濃度治療組、高濃度治療組HUVEC的管腔節(jié)數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、節(jié)段數(shù)及相對(duì)管腔長(zhǎng)度均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；低濃度治療組與高濃度治療組間各指標(biāo)相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)?？梢?jiàn)，與正常對(duì)照組相比，VEGF誘導(dǎo)后的HUVEC存在明顯的管腔變化，而在應(yīng)用不同濃度SPIRR NPs治療后，VEGF誘導(dǎo)的管腔變化被有效抑制，管腔形成被顯著逆轉(zhuǎn)。

圖2 各組管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A：正常對(duì)照組；B：VEGF干預(yù)組；C：低濃度治療組；D：高濃度治療組。

2.4 SPIRR NPs的靶向作用ICGA檢測(cè)SPIRR NPs注射前及注射后不同時(shí)間點(diǎn)在CNV部位的顯影結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，CNV病灶處出現(xiàn)熒光，表明SPIRR NPs可靶向至CNV病灶；隨著時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，最終可保持90 d左右，表明SPIRR NPs可以在CNV部位長(zhǎng)期存在并工作。

圖3 ICGA檢測(cè)SPIRR NPs注射前及注射后不同時(shí)間點(diǎn)在CNV部位的顯影 A：造模后7 d藥物注射時(shí)；B：造模后14 d；C：造模后28 d；D：造模后90 d。

2.5 靜脈注射SPIRR NPs對(duì)小鼠CNV形成的影響FFA檢測(cè)結(jié)果(圖4)可見(jiàn)，對(duì)照組與PBS組在CNV處熒光面積大小相似，無(wú)明顯差異，而SPIRR組和RBZ組CNV處的熒光滲漏面積明顯減小。視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜鋪片F(xiàn)ITC-dextran和IB4染色結(jié)果顯示(圖5)，PBS組、S-PEG組、SPIRR組和RBZ組CNV病變面積分別為(12 923.18±3325.11)μm2、(13 106.10±3660.18)μm2、(2403.31±320.43)μm2和(2529.60±139.08)μm2，兩兩比較結(jié)果顯示，PBS組與S-PEG組、SPIRR組與RBZ組間CNV病變面積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，其余組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

圖4 FFA觀察各組CNV部位熒光滲漏情況 A：各組FFA檢查結(jié)果；B：A圖熒光滲漏部位放大圖。

2.6 SPIRR NPs對(duì)血清指標(biāo)的影響各組小鼠血清中ALT、AST、Cr、T-CHO、TG、K+、Ca2+、Cl-水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。SPIRR NPs濃度在1.25～10.00 g·L-1時(shí)的溶血試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，其中10.00 g·L-1時(shí)的溶血率為(0.95±0.52)%，未超過(guò)國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)10%(圖6) 。

圖5 FITC-dextran灌注熒光染色與IB4雙染觀察各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜鋪片CNV病灶大小

圖6 各組小鼠血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 A：肝腎指標(biāo)ALT、AST、Cr檢測(cè)結(jié)果；B：血脂指標(biāo)T-CHO、TG檢測(cè)結(jié)果；C：電解質(zhì)K+、Ca2+、Cl-檢測(cè)結(jié)果。NS：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

濕性AMD由于其會(huì)在黃斑區(qū)出現(xiàn)CNV導(dǎo)致黃斑出血、水腫，進(jìn)而引發(fā)視力下降，現(xiàn)已成為影響中老年人視力的主要因素之一[8]。已有研究發(fā)現(xiàn),在AMD患者的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到高表達(dá)的整合素αvβ3[9]，而RGD能夠與αvβ3特異性結(jié)合。同時(shí)，表面修飾RGD多肽的脂質(zhì)體能夠轉(zhuǎn)載光敏劑或抗VEGF藥物，通過(guò)靜脈注射的方式來(lái)達(dá)到治療CNV效果[10]。而PEG作為核交聯(lián)星型高分子一員，不僅具有高度交聯(lián)的核，“臂”的數(shù)目也更多，具有的獨(dú)特構(gòu)型可以增加藥物的穩(wěn)定性和偶聯(lián)物在血液中的滯留時(shí)間，目前作為納米載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域[11]。Li等[12]構(gòu)建了在中性pH條件下也能響應(yīng)的納米給藥平臺(tái)，利用PEG作為外殼包覆抗壞血酸納米球，以增強(qiáng)其在腫瘤組織中的滲透和滯留效應(yīng)。Zhao等[13]利用PEG為載體結(jié)合HPV16E7肽和CpGODN，組裝成了穩(wěn)定且具有高載藥量的LipE7/CpG疫苗，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫和改善腫瘤相關(guān)免疫抑制而發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)通過(guò)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該疫苗未引起主要器官的形態(tài)學(xué)改變，無(wú)明顯毒性反應(yīng)，能夠安全用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究。因此本研究以PEG為原料行RAFT反應(yīng)，成功制備得到了以星型高分子為載體、鍵載RGD靶向基團(tuán)，并負(fù)載抗VEGF藥物的納米顆粒SPIRR NPs。

納米顆粒具有功能化結(jié)構(gòu)及易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，然而其潛在毒性是納米顆粒在應(yīng)用前需要考慮的一個(gè)問(wèn)題，已有文獻(xiàn)[14]報(bào)道，陽(yáng)離子樹狀大分子破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)具有細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。 Barrios-Gumiel等[15]通過(guò)改變樹狀大分子的生成和樹狀大分子/PEG的比例來(lái)達(dá)到聚乙二醇基化納米顆粒的目的，降低了樹狀大分子固有的分子毒性。因此，在本研究中，我們?cè)黾恿薖EG在納米顆粒中的比例， 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明SPIRR NPs并未影響細(xì)胞存活率，與前期報(bào)道結(jié)果一致，為進(jìn)一步研究其療效提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

溶血主要是由于外因引起的紅細(xì)胞通透性升高使得細(xì)胞裂解，導(dǎo)致血紅蛋白的釋放。溶血試驗(yàn)是評(píng)估靜脈注射制劑能否安全應(yīng)用的一項(xiàng)重要指標(biāo)，Zhong等[16]利用溶血試驗(yàn)評(píng)估了納米氧化鋅/殼聚糖微球的生物安全性。本研究通過(guò)溶血試驗(yàn)證明，在研究濃度范圍內(nèi)，即使納米顆粒濃度增加到10.00 g·L-1，溶血率仍然遠(yuǎn)低于1.0%，證明該納米顆粒具有很好的血液相容性，能夠安全用于靜脈注射。

正常情況下，靜脈制劑注射后會(huì)通過(guò)血液進(jìn)入全身循環(huán)，肝臟和腎臟是人體重要的代謝器官，我們參考Vangaveti等[17]的方法，使用血清學(xué)檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)器官的毒性，結(jié)果顯示，各血清學(xué)指標(biāo)并沒(méi)有明顯增加，也沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的變化。因此認(rèn)為該納米材料具有很好的生物相容性。

血管生成被定義為從原有血管中形成新的毛細(xì)血管，成纖維細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞外基質(zhì)和局部釋放VEGF促使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生活化和遷移，突破Bruch膜向視網(wǎng)膜下遷移，遷移后的內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)增殖形成了管腔，最終形成了新生血管，造成了CNV的發(fā)生[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF誘導(dǎo)后的HUVEC可觀察到明顯的管腔形成，這與新生血管的形成過(guò)程是一致的。Suzuki等[20]報(bào)道，抑制VEGF介導(dǎo)的管腔形成可以減少新生血管的形成，從而延緩CNV的發(fā)展。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用SPIRR NPs后，VEGF誘導(dǎo)的管腔形成被顯著抑制，可見(jiàn)管腔節(jié)數(shù)減少、長(zhǎng)度縮短等現(xiàn)象。

在本研究中，我們使用了視網(wǎng)膜激光光凝的CNV小鼠作為動(dòng)物模型來(lái)完成體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，激光誘導(dǎo)CNV作為一種依賴于VEGF因子的造模方式，其過(guò)程可以被抗VEGF藥物抑制，因此激光誘導(dǎo)的CNV模型被廣泛應(yīng)用[21]?？筕EGF藥物的應(yīng)用已經(jīng)被認(rèn)為是CNV的一線治療策略，其中包括單克隆抗體片段雷珠單抗和單克隆抗體貝伐單抗等。雷珠單抗是一種高親和力的重組Fab，可以中和所有亞型的VEGF-A[22]。最近有研究顯示，雷珠單抗可以有效減少激光誘導(dǎo)動(dòng)物模型中的CNV面積[23]。通過(guò)RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜鋪片F(xiàn)ITC-dextran和IB4染色及FFA觀察CNV病灶大小，結(jié)果均顯示尾靜脈注射SPIRR NPs后的病灶顯著減少。

綜上所述，RGD修飾的S-PEG被設(shè)計(jì)為一種強(qiáng)有力的載體，可以將抗VEGF藥物輸送到CNV區(qū)域。體外實(shí)驗(yàn)中，我們所合成的SPIRR NPs無(wú)細(xì)胞毒性，在所研究的濃度范圍內(nèi)不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的管腔形成具有顯著的抑制效果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，較低的溶血率使之可安全地用于靜脈注射，同時(shí)不影響肝、腎功能，脂代謝和電解質(zhì)等重要指標(biāo)，保證了其被進(jìn)一步應(yīng)用的生物安全性。更重要的是，抗VEGF藥物可以被靶向輸送到CNV區(qū)域，并在那里停留較長(zhǎng)時(shí)間，以維持抗VEGF的效果。通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)觀察可見(jiàn)CNV面積顯著減少，總體而言，SPIRR NPs具有良好的細(xì)胞相容性，在CNV治療中具有很大的藥物輸送潛力。