石琛 肖啟國 王智 劉翀 張亞蘭 劉明之

角膜新生血管是角膜常見的病理改變，也是常見的致盲原因，探明角膜新生血管的發(fā)生機制，尋找有效的防治藥物具有重要的臨床意義。米諾環(huán)素是一種半合成抗生素，除了具有廣譜的抗菌作用外，還具有抗炎[1-2]、抗血管生成、抑制基質金屬蛋白酶的產生和活性等[3-4]作用。本研究通過建立堿燒傷大鼠角膜新生血管模型，探討米諾環(huán)素對堿燒傷后角膜新生血管生成的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取6～8周齡SPF級健康SD大鼠72只(取右眼為實驗眼)，體質量200～250 g(南華大學動物實驗中心提供)。實驗前常規(guī)裂隙燈檢查，排除眼表相關疾病。

1.1.2 主要儀器與試劑裂隙燈顯微鏡及攝像系統(tǒng)[卡爾蔡司(中國)有限公司]，米諾環(huán)素鹽酸鹽(中國生工生物工程股份有限公司)，CD206、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)單克隆抗體(武漢貝茵萊生物科技有限公司)，Trizol核酸蛋白提取試劑(上海昂博生物技術有限公司)，YBR Green PCR試劑盒[安諾倫(北京)生物科技有限公司]，逆轉錄試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司]，二抗Max Vision TM (鼠/兔)試劑、PBS緩沖液以及各種引物(武漢華聯(lián)科生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組造模前3 d，予大鼠雙眼滴妥布霉素滴眼液清潔結膜囊。從72只大鼠中隨機選取24只(24眼)作為空白對照組(不做任何干預)，其余48只大鼠按照4 mL·kg-1標準給予100 g·L-1水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，并給予鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼3次，將用1 mol·L-1NaOH浸潤過的實驗濾紙置于大鼠右眼角膜中央40 s，之后用生理鹽水沖洗結膜囊60 s，建立角膜堿燒傷模型，然后隨機分為溶劑對照組和米諾環(huán)素組，每組24只(24眼)。溶劑對照組在大鼠角膜堿燒傷后給予9 g·L-1NaCl溶液(10 mL·kg-1)腹腔注射，米諾環(huán)素組在大鼠角膜堿燒傷后給予米諾環(huán)素溶液(45 mg·kg-1)腹腔注射。

1.2.2 大鼠角膜相關檢查項目分別于堿燒傷后1 d、4 d、7 d、14 d用裂隙燈觀察大鼠角膜上皮缺損及角膜新生血管情況并拍照。參照文獻[5]方法，將角膜由水平、垂直兩軸劃分為4個部分，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量4個部分彎曲度小且向角膜中央延伸最長血管的長度，分別計算各部分角膜新生血管面積并求和。然后在每個時間點每組隨機抽取6只大鼠，處死并摘取角膜組織，分別用于HE染色、免疫組織化學染色和實時熒光定量PCR檢測。

1.2.2.1 HE染色和免疫組織化學染色將各組大鼠角膜組織固定、包埋、切片，采用HE染色結合Image J圖像分析系統(tǒng)進行炎癥細胞計數(shù)；采用二步法進行免疫組織化學染色檢測TNF-α、CD206蛋白表達，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對所拍攝照片中陽性反應部位進行分析，測累積光密度值(IOD值)，每個標本重復檢查3次取平均值。

1.2.2.2 實時熒光定量PCR檢測采用實時熒光定量PCR檢測各組大鼠角膜組織中一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)mRNA的相對表達量。取大鼠角膜組織置于Trizol中，提取總RNA，消除總RNA中的DNA及DNase1，采用實時熒光定量PCR試劑盒進行反轉錄，擴增iNOS、Arg-1 mRNA，將β-actin作為內參照。引物序列如下：iNOS正向引物為 5’-GGCTGAAGTGGTATGC-3’，反向為5’-CCAGTGTGTGGGTCTC-3’；Arg-1正向引物為5’-TCCCCAATGACAGCCC-3’， 反向為5’-CCACCCAAATGACGCA-3’；β-actin正向引物為5’-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3’，反向為5’-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3’。用相對定量方法2-△△Ct進行計算，以空白對照組作為參照，計算米諾環(huán)素組、溶劑對照組目的基因mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析對實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，各組間比較采用單因素方差分析。對溶劑對照組Arg-1 mRNA相對表達量與角膜新生血管長度和面積進行Pearson相關分析。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 眼表形態(tài)及角膜新生血管生成情況整個實驗過程中，空白對照組大鼠角膜透明，無角膜新生血管。堿燒傷后1 d，溶劑對照組、米諾環(huán)素組均觀察到大鼠結膜混合性充血，未見明顯角膜新生血管長出。堿燒傷后4 d、7 d、14 d，米諾環(huán)素組及溶劑對照組均可見角膜新生血管長出，但米諾環(huán)素組角膜新生血管長度及面積均小于溶劑對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)(見圖1和表1)。

圖1 溶劑對照組、米諾環(huán)素組大鼠角膜堿燒傷后裂隙燈下眼表改變

表1 溶劑對照組、米諾環(huán)素組大鼠角膜堿燒傷后不同時間角膜新生血管長度及面積比較

2.2 角膜炎癥細胞計數(shù)情況HE染色發(fā)現(xiàn)，空白對照組角膜結構清晰，上皮細胞排列整齊，無血管結構。堿燒傷后1 d，米諾環(huán)素組及溶劑對照組均可見不同程度角膜上皮缺損、組織結構紊亂，兩組大鼠角膜炎癥細胞數(shù)無明顯差異。堿燒傷后4 d、7 d、14 d，溶劑對照組與米諾環(huán)素組每個視野(×200)炎癥細胞數(shù)分別為(119.83±7.28)個、(81.83±8.30)個，(92.50±7.34)個、(42.33±9.11)個，(48.33±7.76)個、(16.67±4.93)個，各時間點兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)，米諾環(huán)素組炎癥細胞數(shù)均少于溶劑對照組。

2.3 角膜組織中iNOS、Arg-1 mRNA表達變化實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，與空白對照組相比，堿燒傷后1 d、4 d、7 d、14 d溶劑對照組iNOS、Arg-1 mRNA相對表達量均升高(均為P<0.05)；與溶劑對照組相比，堿燒傷后4 d、7 d米諾環(huán)素組iNOS mRNA相對表達量均明顯減少(均為P<0.05)，而在堿燒傷后1 d、14 d，兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；與溶劑對照組相比，米諾環(huán)素組Arg-1 mRNA相對表達量在堿燒傷后14 d顯著減少(P<0.01)，而在堿燒傷后1 d、4 d、7 d，兩組差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(見圖2)。

2.4 堿燒傷后M2型巨噬細胞和M1型巨噬細胞在角膜組織占比優(yōu)勢分析將空白對照組Arg-1和iNOS mRNA相對表達量比值設為1，如實驗組比值>1表明M2型巨噬細胞占優(yōu)勢，比值<1則表明M1型巨噬細胞占優(yōu)勢。結果顯示，溶劑對照組堿燒傷后4 d、7 d、14 d，Arg-1和iNOS mRNA相對表達量比值分別為0.73±0.14、0.82±0.90、1.71±0.21(均為P<0.01)。

2.5 Arg-1 mRNA相對表達量與角膜新生血管長度、面積相關性分析結果雙變量相關性分析結果顯示，溶劑對照組中Arg-1 mRNA相對表達量與角膜新生血管長度和面積均呈顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.898(P=0.000)、0.781(P=0.000)。

2.6 角膜組織中TNF-α、CD206蛋白表達情況免疫組織化學染色檢測結果顯示，空白對照組實驗全程角膜組織中均未見TNF-α、CD206蛋白表達；堿燒傷后1 d、4 d，溶劑對照組與米諾環(huán)素組相比，TNF-α、CD206蛋白表達的IOD值差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；堿燒傷后7 d、14 d，溶劑對照組TNF-α、CD206蛋白表達的IOD值均高于米諾環(huán)素組(均為P<0.05)(見圖3)。

圖3 堿燒傷后不同時間溶劑對照組與米諾環(huán)素組角膜組織中TNF-α、CD206蛋白表達的IOD值 *P<0.05。

3 討論

尋找有效防治角膜新生血管的藥物并探明其作用機制，是目前眼科學者關注的熱點。本研究中，我們通過觀察堿燒傷后角膜形態(tài)學變化發(fā)現(xiàn)，使用米諾環(huán)素干預4 d后，大鼠角膜新生血管長度及面積較溶劑對照組均明顯減少，炎癥細胞浸潤下調，說明米諾環(huán)素能有效減輕堿燒傷后角膜炎癥反應，抑制堿燒傷后角膜新生血管的生成。

既往研究提示，巨噬細胞與脈絡膜、視網(wǎng)膜新生血管生成均密切相關，但巨噬細胞在角膜新生血管形成中所產生的作用一直存在爭議。Sakurai等[6]研究表明，氯磷酸脂質體誘導的巨噬細胞凋亡抑制了角膜新生血管的生成，而其他的研究[7]則與此相反，這一矛盾產生的原因可能是由巨噬細胞的不同表型引起的。巨噬細胞是機體重要的免疫細胞之一，具有高度可塑性，它可在各種趨化因子和細胞因子驅動下極化為促進炎癥反應的M1型和促進血管生成的M2型，這在調控炎癥反應、血管生成、組織損傷修復中起重要作用[8-9]。為了證實巨噬細胞極化是否調控角膜新生血管的生成，本研究對堿燒傷后角膜中M1型及M2型巨噬細胞相關標志物進行了檢測。以往研究表明[10]，巨噬細胞向M1型極化時，iNOS、TNF-α呈高表達；而向M2型極化時，大量分泌Arg-1、CD206等因子，因此檢測iNOS、TNF-α、Arg-1、CD206等的表達水平可反映巨噬細胞向不同表型的極化情況。本研究通過檢測上述細胞因子的表達發(fā)現(xiàn)，在堿燒傷早中期，M1型巨噬細胞占明顯優(yōu)勢，而在堿燒傷后期，M2型巨噬細胞逐漸占優(yōu)。而角膜形態(tài)學檢查及HE染色結果顯示，隨著堿燒傷后時間延長，角膜組織中炎癥細胞逐漸減少，角膜新生血管逐漸增加，且與M2型巨噬細胞細胞標志物呈正相關。由于M1型巨噬細胞可以分泌大量的炎癥因子，而M2型巨噬細胞則可以促進新生血管的發(fā)生發(fā)展，說明巨噬細胞極化調控了堿燒傷后角膜炎癥的發(fā)生及角膜新生血管的生成。

修彬華等[11]建立了蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型，通過檢測巨噬細胞活化標志物Iba-1的表達，發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可以抑制巨噬細胞活化，進而減輕促炎因子、活性氧等物質誘發(fā)的一系列病理損傷，改善血管病變。為了明確米諾環(huán)素抑制角膜堿燒傷后新生血管化與巨噬細胞極化的關系，我們將溶劑對照組與米諾環(huán)素組的數(shù)據(jù)進行了對比，結果顯示，米諾環(huán)素在堿燒傷后早期顯著減輕了角膜堿燒傷后炎癥反應，并且降低了M1型巨噬細胞相關標記物(iNOS及TNF-α)的表達水平，而在堿燒傷后晚期，米諾環(huán)素則抑制了M2型巨噬細胞相關標記物(Arg-1及CD206)的表達。這些結果表明，米諾環(huán)素抑制角膜堿燒傷誘導的角膜新生血管生成過程，這可能與巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化被抑制，而向M2型巨噬細胞極化增強有關，即極化的巨噬細胞可能恢復成非極化表型，當活化的巨噬細胞被抑制而重新轉變到沉默狀態(tài)時，角膜新生血管的生成將受到抑制。

綜上所述，我們的研究初步表明巨噬細胞極化調控角膜堿燒傷后新生血管的生成，米諾環(huán)素可能通過調控巨噬細胞的極化，抑制堿燒傷后角膜新生血管的生成，這為闡明角膜新生血管的發(fā)生及米諾環(huán)素的作用機制提供了新認識。