陳 果,郭東風(fēng),許 磊,劉國榮,陳雅靜,袁曉燕,杭 敏,王 佩,羅婭娟

(上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院急診科,上海 200135)

急性膿毒癥是目前臨床中較為常見的危重性疾病，隨著患者病情進(jìn)展可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)多臟器功能不全綜合征、急性呼吸窘迫綜合征等[1]。有研究指出，毛細(xì)血管滲漏是典型的膿毒癥病理學(xué)特征，其主要表現(xiàn)為微血管內(nèi)皮細(xì)胞受炎癥因子影響致細(xì)胞凋亡引起出現(xiàn)內(nèi)皮屏障功能受損，導(dǎo)致血管通透性增高[2，3]。B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)是人體內(nèi)重要的抗凋亡蛋白家族成員，可有效抑制細(xì)胞的凋亡[4]。熱休克蛋白70(HSP70)是體內(nèi)重要的分子伴侶，可通過多種途徑和多種凋亡誘導(dǎo)因子，進(jìn)而起到抑制凋亡的作用[5]。但HSP70對急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞的影響仍鮮有報(bào)道，本文選擇急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對象，分析HSP70調(diào)控急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，選取2017年2月～2018年12月本院收治的3例急性膿毒癥患者作為觀察組，其中男性2例，女性1例，年齡分別為43、31、52歲，同期選擇3例行手術(shù)治療的骨折患者作為對照組，其中男性2例，女性1例，年齡分別為54、29、44歲，對照組患者除骨折外無其他疾病，分組合理。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

(1)心率大于90次/min、PaCO2<32 mmHg或呼吸頻率>20次/min；(2)末梢血白細(xì)胞<4 000 mm3或>12 000/mm3；(3)體溫低于36℃或高于38℃；(4)幼稚細(xì)胞>10%。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)伴隨慢性阻塞性肺部疾病、冠心病、腫瘤、高血壓、糖尿病、風(fēng)濕免疫疾病、血液系統(tǒng)疾病、肝腎功能不全或肝硬化等疾病；(2)大于75歲成年人或未成年人；(3)無法全程參與該試驗(yàn)；(4)酗酒或抽煙史；(5)主動(dòng)申請退出本研究。

1.4 方法

本組研究中所有受試者入組后采集手術(shù)區(qū)域或介入治療創(chuàng)面周圍皮膚。將標(biāo)本剪成小塊，放入含抗菌素的DMEM培養(yǎng)基中，并將培養(yǎng)基浸泡組織置入5℃冰箱中保存。經(jīng)組織自培養(yǎng)基中取出后使用105的乳酸環(huán)丙沙星和105青霉素溶液清洗3次，并剪成1 mm3大小組織塊后置于培養(yǎng)皿(DMEM培養(yǎng)基潤洗)中，后加入完全培養(yǎng)基并置入二氧化碳培養(yǎng)箱中2 h，60 h后將組織塊去除，待細(xì)胞匯合呈單層細(xì)胞后凍存并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每24 h更換一次完全培養(yǎng)基，后滴入2～3滴胰酶，10 s后將培養(yǎng)基去除加入新完全培養(yǎng)基。倒置顯微鏡觀察待細(xì)胞達(dá)全部的80%左右使用胰酶消化60 s左右，后加入等體積胎牛血清終止消化，收集細(xì)胞置入10 mL離心管中加入培養(yǎng)基至10 mL，使用離心機(jī)1 000 r/min離心10 min，去除上清后加入2 mL完全培養(yǎng)基吹打均勻，后依照細(xì)胞懸液和完全培養(yǎng)基1∶2的比例進(jìn)行傳代。

1.5 分組及處理

使用完全DMED培養(yǎng)基對提取的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并在細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后將各細(xì)胞分為空白對照組及10、50、100 mg/L組，依照分組采用不同劑量的HSP70蛋白進(jìn)行干預(yù)。后采用噻唑藍(lán)法(MTT)檢測各組細(xì)胞活力，使用Hoechst 33258染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色并采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)，通過透射電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞自噬體。采用Western blot法檢測各組細(xì)胞中Bcl-2、Beclin-1及β-actin蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力檢測結(jié)果

HSP70的干預(yù)可有效改善急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞活力，其中觀察組和對照組中100 mg/L亞組細(xì)胞活力最高，空白對照亞組細(xì)胞活力最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 細(xì)胞活力檢測結(jié)果

2.2 熒光染色調(diào)查結(jié)果

與對照組比較，急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核缺損嚴(yán)重，采用HSP70的干預(yù)可有效改善細(xì)胞核形態(tài)，其中100 mg/L亞組的細(xì)胞核形態(tài)最佳，見圖1。

A、B、C、D為觀察組患者(空白對照組、10 mg/L組、50 mg/L組、100 mg/L組)；E、F、G、H為對照組患者(空白對照組、10 mg/L組、50 mg/L組、100 mg/L組)圖1 熒光染色圖Fig 1 Result of fluorescentstaining

2.3 觀察組患者內(nèi)皮細(xì)胞自噬體檢測結(jié)果

本組研究結(jié)果顯示，采用HSP70對急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞干預(yù)后干顯著改善患者自噬體形態(tài)和結(jié)構(gòu)，其中100 mg/L亞組的自噬體形態(tài)和結(jié)構(gòu)形態(tài)最佳，見圖2。

A、B、C、D為觀察組患者(空白對照組、10 mg/L組、50 mg/L組、100 mg/L組)圖2 內(nèi)皮細(xì)胞自噬體檢測結(jié)果Fig 2 Autophagosome of endothelial cells

2.4 各組患者內(nèi)皮細(xì)胞蛋白水平檢測結(jié)果

HSP70的干預(yù)可有效改善急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Beclin-1水平，其中觀察組和對照組中的100 mg/L亞組中Bcl-2及Beclin-1水平最高，空白對照亞組中最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞蛋白水平檢測結(jié)果

3 討論

膿毒癥是目前臨床中較為常見的由感染所導(dǎo)致的全身炎癥性反應(yīng)綜合征，其在臨床中多被證實(shí)為細(xì)菌或高度感染灶[6]。雖然膿毒癥的發(fā)生及發(fā)展與感染密切相關(guān)，但其在病發(fā)膿毒癥后可能導(dǎo)致疾病遵循自身病理規(guī)律和過程進(jìn)行發(fā)展，對患者的生命安全造成嚴(yán)重不良影響[7，8]。急性膿毒癥發(fā)生及發(fā)病機(jī)制尚未完全揭示，其可能涉及到復(fù)雜的全身炎癥性網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、免疫功能障礙、基因多態(tài)性、組織損傷、凝血功能異常及宿主對毒素、病原微生物反應(yīng)等多因素密切相關(guān)[9]。

HSP70是重要的熱休克蛋白家族成員，其可有效抑制凋亡的發(fā)生及發(fā)展，并在多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程中起到十分重要的保護(hù)作用[10]。有研究結(jié)果顯示，IGF-1等多種細(xì)胞因子可有效調(diào)控牦牛卵丘細(xì)胞中HSP70的表達(dá)，且可有效調(diào)控細(xì)胞凋亡[11]。研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可有效誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞中HSP 70的表達(dá)，且HSP70變化可促進(jìn)胚胎適應(yīng)環(huán)境改變，使細(xì)胞可有效保持和維護(hù)最佳的質(zhì)量[12，13]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可有效調(diào)控HSP70蛋白表達(dá)水平，并可有效減少熱應(yīng)激對細(xì)胞的損傷和凋亡的應(yīng)用，可更為有利地促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育[14-16]。

本研究采用HSP70對急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞的影響進(jìn)行分析，結(jié)果顯示HSP70蛋白干預(yù)后可有效提高急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞活力，有效改善細(xì)胞核形態(tài)及自噬體。進(jìn)一步深入分析發(fā)現(xiàn)，采用HSP70干預(yù)后可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Beclin-1蛋白水平，分析認(rèn)為HSP70蛋白可有效改善急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白表達(dá)，有效激活抗凋亡相關(guān)信號通路[17，18]。Bcl-2是人體內(nèi)重要的凋亡抑制基因，其中Bcl-2高表達(dá)可有效阻滯多用因素引起的細(xì)胞凋亡，應(yīng)激、生長因子缺失等[19]。Beclin-1蛋白是人體內(nèi)重要的自噬啟動(dòng)基因，其可與PI3K蛋白形成復(fù)合物[20]，有效調(diào)節(jié)體內(nèi)ATG蛋白自噬前體的定位，促進(jìn)自噬體形成，采用HSP70干預(yù)后可有效改善細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Beclin-1蛋白水平表達(dá)，進(jìn)而可有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，HSP70可有效調(diào)控急性膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞中Bcl-2水平，有效抑制細(xì)胞凋亡并緩解細(xì)胞皮膚損傷。