張宇昕，蓋 聰，馬浩潔，程翠翠，張錦坤，楊璐平，馮琬迪，周夢琪，趙海虹，胡 蝶，孫紅梅

(北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)中醫(yī)學(xué)院，北京 102488)

抑郁癥是一種高患病率、高復(fù)發(fā)率和高自殺率的慢性精神疾病[1]。大量基礎(chǔ)和臨床研究表明，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神經(jīng)元功能異常在其中發(fā)揮重要作用[2]。神經(jīng)元周圍基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)(perineuronal nets, PNNs)是一種主要包繞在小清蛋白(parvalbumin, PV)陽性(PV+)GABA能神經(jīng)元周圍的細胞外基質(zhì)[3]，研究發(fā)現(xiàn)PNNs結(jié)構(gòu)異常參與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)病過程[4]，然而其在抑郁癥中的作用目前尚不明確。因此，本研究擬通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictability mild stress，CUMS)建立抑郁動物模型，檢測大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex, mPFC)腦區(qū)PNNs水平，及其主要組分蛋白聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、短小蛋白聚糖(Brevican)和GABA主要合成酶谷氨酸脫羧酶67(glutamic acid decarboxylase 67，GAD67)的表達水平，探討應(yīng)激對PNNs及GABA能神經(jīng)元功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制備

健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠28只(220～240 g)，由北京維通利華公司提供。實驗前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為對照組和模型組，每組14只。模型組大鼠給予4周CUMS建立抑郁癥模型[5]，每天隨機選取一種長應(yīng)激(禁水24 h、禁食24 h、擁擠24 h、傾斜24 h、持續(xù)光照24 h)和一種短應(yīng)激(冷水游泳5 min、夾尾60 s、束縛2 h、頻閃4 h、白噪音4 h)，同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，防止動物產(chǎn)生適應(yīng)性。對照組不做任何處理。28 d后進行行為學(xué)檢測。每組4只用于免疫熒光實驗，10只用于檢測蛋白表達。

1.2 行為學(xué)檢測

1.2.1糖水偏愛實驗[6](sucrose preference test，SPT) 采用該實驗考察應(yīng)激是否導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)快感缺失癥狀。測試分為兩個階段：適應(yīng)階段，第1天給予大鼠2瓶1%糖水適應(yīng)24 h，第2天給予1%糖水和純水各1瓶，12 h后調(diào)換位置；測試階段，第3天1%糖水和純水各1瓶稱重后給予大鼠，24 h后稱重，計算糖水偏愛值和總飲水量。糖水偏愛值=糖水?dāng)z入量/(糖水?dāng)z入量+純水?dāng)z入量)×100%?？傦嬎?(糖水?dāng)z入量+純水?dāng)z入量)(mg)/體重(g)。

1.2.2新穎環(huán)境抑制攝實驗[7](novelty inhibited feeding test，NSFT) 采用該實驗考察應(yīng)激是否導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。大鼠禁食24 h后在長75 cm、寬75 cm、高45 cm的曠場中進行測試。曠場中央放置幾粒食物，將動物放入曠場角落，記錄大鼠的攝食潛伏期，若10 min內(nèi)大鼠未開始攝食，則攝食潛伏期以600 s計。測試結(jié)束后將大鼠放入飼養(yǎng)籠(熟悉環(huán)境)中自由攝食，記錄5 min內(nèi)食物消耗量反映大鼠食欲，食物消耗量=攝食重量(mg)/體重(g)。

1.2.3強迫游泳實驗[6](forced swimming test，F(xiàn)ST) 采用該實驗考察應(yīng)激是否導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)絕望行為。強迫游泳實驗在直徑20 cm、高50 cm的透明玻璃缸中進行，水深30 cm，水溫±25℃。大鼠游泳時，需保證其四肢或尾巴不能觸及桶底。實驗第1天進行15 min游泳適應(yīng)，第2天(24 h后)進行5 min的強迫游泳測試，記錄大鼠的漂浮不動時間。

1.3 免疫熒光實驗

檢測PNNs密度及PNNs和PV雙標(biāo)陽性(PNNs+PV+)神經(jīng)元占PV+神經(jīng)元百分比。每組4只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，使用PBS灌注，再用4%多聚甲醛灌流固定，取腦后放入4%多聚甲醛后固定1 d，再先后置于20%和30%的蔗糖溶液中梯度脫水。脫水后取mPFC腦組織20 μm冷凍切片，每次收集相距300 μm的腦片(每15張腦片取1張)以避免對同一細胞重復(fù)測量，每組至少選取5張腦片用于統(tǒng)計[8]。PBS洗5 min×3次，置于多花紫藤的凝集素(1∶200，Sigma Aldrich)和Anti-Parvalbumin antibody(1∶500，Sigma Aldrich)封閉液溶液中行免疫熒光雙標(biāo)，4 ℃過夜，PBS洗5 min×3次，室溫孵育置于Fluoro TagTMFITC偶聯(lián)試劑盒(1∶200，Sigma Aldrich)和Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)(1∶500，Abcam)封閉液溶液3 h，PBS洗5 min×3次，封片。在熒光顯微鏡下觀察并采用image J軟件計數(shù)并分析mPFC腦區(qū)PNNs密度以及PNNs+PV+神經(jīng)元占PV+神經(jīng)元百分比。

1.4 Western blot實驗

檢測Aggrecan、Brevican及GAD67蛋白表達。每組10只大鼠斷頭取腦，正己烷驟冷20 s取出，存于-80℃。選取mPFC腦區(qū)進行腦組織勻漿，勻漿后4℃下靜置30 min、離心10 min，取上清繼續(xù)離心30 min后取上清液。用BCA法測定蛋白含量，采用SDS-PAGE凝膠電泳，每道加20 μg蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，分別加入Aggrecan(1∶1 000，Abcam)、Brecican(1∶1 000，Abcam)、GAD67(1∶5 000，Abcam)、β-actin(1∶2 000，Proteintech)抗體孵育4℃過夜，洗脫一抗后孵育相應(yīng)的二抗(1∶5 000，北京中杉金橋)1 h，ECL熒光法顯色，應(yīng)用Image J軟件進行定量分析。實驗組的數(shù)值比相應(yīng)的對照組數(shù)值，得到比值為最終表征蛋白水平的數(shù)據(jù)[6]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

模型組糖水偏愛率較對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但兩組的總飲水量無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.17)；模型組的攝食潛伏期較對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但兩組5 min內(nèi)食物消耗量無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.59)，提示CUMS對大鼠的食欲無影響；模型組5 min內(nèi)大鼠漂浮不動時間較對照組延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各項行為學(xué)指標(biāo)均表明模型組產(chǎn)生抑郁與焦慮樣行為，提示抑郁癥模型造模成功。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)

2.2 免疫熒光結(jié)果

與對照組比較，PNNs及PNNs+PV+神經(jīng)元占 PV+神經(jīng)元百分比均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 免疫熒光表達情況

圖1 PNNs、PV+神經(jīng)元及其PNNs + PV+表達情況Fig 1 The expression of PNNs, PV+ neurons and their PNNs+ PV+

2.3 western blot結(jié)果

模型組PNNs組分蛋白Aggrecan、Brevican，GABA合成酶GAD67水平較對照組均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、3及表3。

圖2 相關(guān)蛋白表達情況

注：與對照組比較，**P<0.01。圖3 各組分蛋白分析比較Fig 3 Analysis and comparison of each component protein

表3 各組蛋白水平

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，4周CUMS導(dǎo)致大鼠mPFC腦區(qū)PNNs密度及PNNs+PV+神經(jīng)元占PV+神經(jīng)元百分比明顯下降，且PNNs的主要組分蛋白Aggrecan、Brevican的表達量也下調(diào)。此外，研究觀察抑郁模型大鼠mPFC腦區(qū)內(nèi)GABA的主要合成酶GAD67含量變化，模型組較對照組GAD67的蛋白表達降低。本研究成果提示CUMS誘導(dǎo)的抑郁模型大鼠發(fā)病與mPFC腦區(qū)PNNs水平及GABA能神經(jīng)元功能密切相關(guān)。

mPFC腦區(qū)功能異常與抑郁癥、精神分裂癥等多種精神疾病密切相關(guān)，其體積減少也是抑郁癥中最有據(jù)可查的異常之一[9]。mPFC功能障礙與壓力引起的認知和情感缺陷有關(guān)，且mPFC的神經(jīng)元萎縮和突觸結(jié)構(gòu)及功能的改變與抑郁癥的發(fā)病機制密切相關(guān)[10]。在嚙齒類動物中，mPFC損傷的大鼠較正常大鼠應(yīng)激易感性增加，且產(chǎn)生抑郁焦慮樣行為[11]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠mPFC腦區(qū)內(nèi)PNNs組分蛋白及GABA合成酶表達水平變化，進一步證明了mPFC是CUMS誘導(dǎo)的抑郁模型的關(guān)鍵腦區(qū)。

PNNs是細胞外基質(zhì)中的一種特殊結(jié)構(gòu)，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元之間、神經(jīng)膠質(zhì)細胞之間以及神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)之間的信號傳遞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。PNNs異常參與了多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)病過程，如慢性壓力導(dǎo)致青春期大鼠mPFC腦區(qū)PNNs密度降低[6, 13]，PNNs的重要組分Aggrecan和以聚集蛋白聚糖高度代表的6-硫酸化硫酸軟骨素(CS-6)鏈異常可導(dǎo)致精神分裂癥及雙向情感障礙易感性增加[14]。這些研究及本研究結(jié)果均提示CUMS誘導(dǎo)的抑郁模型大鼠發(fā)病與mPFC腦區(qū)PNNs水平降低密切相關(guān)。

PNNs主要包裹在PV+的GABA能神經(jīng)元周圍，發(fā)揮保護和緩沖外界應(yīng)激的作用[15, 16]。因此，PNNs水平下降可能導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元對應(yīng)激等刺激更為敏感，導(dǎo)致神經(jīng)元功能異常。GAD作為GABA的主要合成酶，特異性的表達在GABA能神經(jīng)元中，在抑郁癥患者和長期處于壓力狀態(tài)的動物大腦觀察到GABA和GAD67水平降低[17]。在精神分裂癥等精神疾病中也發(fā)現(xiàn)PNNs水平下降，以及GABA能回路破壞[18]。上述研究及本研究均提示CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠PNNs減少可能導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元功能損傷。

但本研究也存在一定的局限性，例如免疫熒光檢測樣本量較少，可能影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在進一步研究中將增加樣本量，以及探討降解PNNs后大鼠的行為學(xué)改變和對GABA能神經(jīng)元功能的影響。

綜上所述，本研究從基礎(chǔ)研究的角度探討mPFC腦區(qū)中PNNs水平減低及GABA能神經(jīng)元功能異常與慢性應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁相關(guān)，為抑郁癥研究提供了新的思路。本研究也為抑郁癥治療提供了新思路，關(guān)于抗抑郁癥藥物對PNNs的影響也可在進一步研究中繼續(xù)分析。

所有作者聲明此項研究不存在潛在利益沖突關(guān)系。