蔡申燕，石佳勇，駱天炯

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210022)

急性支氣管炎(acute bronchitis)是由微生物感染、物理刺激、化學(xué)刺激或過(guò)敏因素等引起的支氣管黏膜急性炎癥，臨床表現(xiàn)以持續(xù)1～3周的急性咳嗽為主[1]?？人阅壳耙殉蔀閮?nèi)科門診患者就診時(shí)最常見(jiàn)的主訴之一，而急性支氣管炎作為咳嗽的主要病因尤為常見(jiàn)[2]。且急性支氣管炎一旦失治，必會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁灾夤苎譡3]，遷延難愈，嚴(yán)重危害患者身體健康與生活質(zhì)量，也給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成一定負(fù)擔(dān)。急性支氣管炎在中醫(yī)學(xué)中屬“咳嗽病”范疇[1]，而早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時(shí)期中醫(yī)就有了針對(duì)咳嗽的專篇論述[4]，治療經(jīng)驗(yàn)豐富，值得進(jìn)一步的深入挖掘研究。

杏仁、桔梗均為歷代中醫(yī)名家治療肺系疾病的常用藥物，常配伍應(yīng)用于外感咳嗽[5]、肺纖維化[6]、咳嗽變異性哮喘[7]等疾病，也頻繁出現(xiàn)在急性支氣管炎的治療指南中[1，8，9],是止咳的經(jīng)典藥對(duì)。其中杏仁味苦性溫，歸肺、大腸經(jīng)，有降氣、止咳平喘、潤(rùn)腸通便的功效，常用治咳逆上氣、喘促、久病大腸燥結(jié)不利等；桔梗味苦、辛，歸肺經(jīng)，可宣肺利咽、祛痰排膿，常用治痰嗽喘急、胸滿、喉痹咽痛等。杏仁善通降肺氣，桔梗善升提肺氣，二者配伍，升降調(diào)和，既可宣肺化痰，又能降氣止咳平喘，有助于肺的宣降功能恢復(fù)正常。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來(lái)說(shuō)，急性支氣管炎的本質(zhì)是支氣管黏膜的急性炎癥，現(xiàn)有的一些研究亦證明了杏仁中的苦杏仁苷[10]、桔梗中的桔梗皂苷[11]等化學(xué)成分在抗炎方面有一定作用。但每一味中藥都包含著豐富的有效成分，每種有效成分又有著多種不同的作用靶點(diǎn)，中藥的療效并不是某種單一成分的作用，而是多成分、多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果，需全面整體地來(lái)看待。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)是一門從系統(tǒng)層面揭示中藥對(duì)機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用的新興學(xué)科，通過(guò)構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系來(lái)預(yù)測(cè)藥物的作用機(jī)制[12，13]。它改變了傳統(tǒng)的“一個(gè)靶點(diǎn)，一種疾病，一個(gè)藥物”的研究模式，以“多靶點(diǎn)、多通路、多成分”代之，與中醫(yī)學(xué)中的“整體觀念”有異曲同工之妙。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)越來(lái)越多地應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域，成為研究中藥單藥或復(fù)方治療疾病作用機(jī)制的新方法。本研究試通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探討“杏仁-桔?！彼帉?duì)治療急性支氣管炎的可能分子作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療急性支氣管炎的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 “杏仁-桔梗”藥對(duì)所含化學(xué)成分的搜集

本研究基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以關(guān)鍵詞分別檢索杏仁、桔梗的全部化學(xué)成分。

1.2 活性化學(xué)成分的篩選及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的搜集

本研究以以下條件對(duì)所有搜集到的化學(xué)成分進(jìn)行篩選：口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18。篩選出具有較高活性的化學(xué)成分作為候選化學(xué)成分，并在TCMSP平臺(tái)搜集候選化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的確定

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、在線《人類孟德?tīng)栠z傳》數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，https://omim.org)搜集急性支氣管炎(acute bronchitis)的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 作用靶點(diǎn)的篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用R語(yǔ)言“VennDiagram”數(shù)據(jù)包篩選藥物潛在靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)的交集，并將交集的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)構(gòu)建PPI圖，根據(jù)Degree值篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物的活性成分和篩選的交集靶點(diǎn)上傳至Cytoscape3.7.0軟件生成化學(xué)藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得出關(guān)鍵的化學(xué)成分和靶點(diǎn)。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析和基于京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P<0.05，篩選“杏仁-桔?！彼帉?duì)治療急性支氣管炎的主要作用通路。

2 結(jié)果

2.1 “杏仁-桔?！彼帉?duì)所含化學(xué)成分的搜集結(jié)果

通過(guò)TCMSP分別搜集中藥杏仁、桔梗所包含的化學(xué)成分，得到杏仁113個(gè)，桔梗102個(gè)。

2.2 活性化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

將搜集到的化學(xué)成分以口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選，得到杏仁19個(gè)，桔梗7個(gè)，去重后共得到25個(gè)化學(xué)成分，為“杏仁-桔?！彼帉?duì)的候選化學(xué)成分。另外，在TCMSP平臺(tái)上搜集到候選化學(xué)成分的相應(yīng)蛋白靶點(diǎn)共296個(gè)，經(jīng)Uniprot標(biāo)準(zhǔn)化命名，去重后得到127個(gè)。

2.3 疾病靶點(diǎn)的確定

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到急性支氣管炎的疾病靶點(diǎn)1 440個(gè)，在線《人類孟德?tīng)栠z傳》OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到疾病靶點(diǎn)176個(gè)，去重后共得到1 593個(gè)。

2.4 作用靶點(diǎn)的篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

利用OmicShare網(wǎng)站韋恩圖分析篩選出“杏仁-桔?！彼帉?duì)的潛在靶點(diǎn)和急性支氣管炎的疾病相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)共81個(gè)，見(jiàn)圖1。將這些靶點(diǎn)上傳至String網(wǎng)站進(jìn)行靶點(diǎn)間的蛋白互作分析，置信度設(shè)定為大于0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，共有81個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 168條邊，平均Degree為28.8，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，線條代表蛋白之間的聯(lián)系。并利用R語(yǔ)言計(jì)算各靶點(diǎn)Degree，繪制Degree排名前20的核心靶點(diǎn)柱狀圖，見(jiàn)圖3。其中Degree排名前3位的核心靶點(diǎn)有AKT1、TP53、MAPK1等。

圖1 杏仁-桔梗-急性支氣管炎靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the targets of almond-platycodon-acute bronchitis

圖2 靶點(diǎn)蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Target protein-protein interaction network

圖3 核心靶點(diǎn)柱狀圖Fig 3 Histogram of core targets

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.0軟件將25個(gè)化學(xué)成分、81個(gè)靶點(diǎn)、杏仁(XR)、桔梗(JG)和急性支氣管炎(AB)構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。網(wǎng)絡(luò)圖中共包含102個(gè)節(jié)點(diǎn)(18個(gè)化學(xué)成分節(jié)點(diǎn)，81個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，2個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn))和284條邊，有7個(gè)化學(xué)成分與疾病無(wú)關(guān)聯(lián)，未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。圖中綠色代表藥物，黃色代表單獨(dú)成分，橙色代表共有成分，藍(lán)色代表靶點(diǎn)，紅色代表疾病。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析后得出各節(jié)點(diǎn)Degree值，Degree排名較前的化學(xué)成分是：木犀草素(luteolin)、刺槐素(acacetin)、光甘草定(Glabridin)、甘草查爾酮B(Licochalcone B)、豆甾醇(Stigmasterol)。Degree排名較前的靶點(diǎn)是：PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2。以上可能是“杏仁-桔?！彼帉?duì)發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)。也體現(xiàn)了“杏仁-桔梗”藥對(duì)多成分、多靶點(diǎn)治療急性支氣管炎的特點(diǎn)。

圖4 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Network diagram of the drug-composition-target-disease

2.6 GO功能富集分析和 KEGG通路富集分析

將上述交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用OmicShare繪制高級(jí)氣泡圖，獲得423條GO功能條目(P<0.05)，包括322條生物過(guò)程(圖5)，42條細(xì)胞組分(圖6)和59條分子功能(圖7)，其中關(guān)聯(lián)的生物過(guò)程主要有凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖正調(diào)控、一氧化氮合成正調(diào)控等。KEGG通路富集分析獲得100條信號(hào)通路(P<0.05)，主要涉及細(xì)胞凋亡、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等，見(jiàn)圖8。

圖5 “杏仁-桔?！卑悬c(diǎn)的GO生物過(guò)程富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of biological processes of the targets of “almond- platycodon”

圖6 “杏仁-桔?！卑悬c(diǎn)的GO細(xì)胞組成富集分析Fig 6 GO enrichment analysis of cell components of the targets of “almond- platycodon”

圖7 “杏仁-桔梗”靶點(diǎn)的GO分子功能富集分析Fig 7 GO enrichment analysis of molecular functions of the targets of “almond- platycodon”

圖8 “杏仁-桔?！卑悬c(diǎn)的KEGG通路富集分析 Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis of the targets of “almond- platycodon”

3 討論

中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)早在2008年就發(fā)布了關(guān)于急性支氣管炎的中醫(yī)治療指南[8]，根據(jù)其咳嗽咳痰等主要臨床變現(xiàn)將其歸于中醫(yī)肺系疾病“咳嗽”范疇。肺主皮毛，開(kāi)竅于鼻，又為嬌臟，不耐寒熱，易感外邪而發(fā)病。六淫外邪或煙塵等穢濁之氣從皮毛及口鼻而入侵襲人體，首先犯肺，肺氣為邪所困宣降失常，可內(nèi)生痰邪，肺氣挾痰上逆，即發(fā)為咳嗽咳痰。故該病的基本病機(jī)為肺失宣肅、肺氣上逆，治療原則應(yīng)以宣降肺氣止咳為主[1]。“杏仁-桔?！睔v來(lái)是止咳祛痰、調(diào)暢氣機(jī)的常用藥對(duì)，《景岳全書(shū)》中的桔梗杏仁煎、《溫病條辨》中的桑菊飲、杏蘇散等經(jīng)典名方，以及目前市售的感冒清熱顆粒、川貝止咳糖漿等中成藥中均包含這一藥對(duì)，應(yīng)用范圍十分廣泛，涵蓋風(fēng)寒、風(fēng)熱、風(fēng)燥、痰熱等多種常見(jiàn)證型。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，試探討“杏仁-桔?！敝委熂毙灾夤苎走^(guò)程中發(fā)揮療效的可能分子機(jī)制，為臨床相似疾病的治療及中成藥新藥的研發(fā)開(kāi)拓思路。

本研究通過(guò)對(duì)杏仁、桔梗有效成分的分析，構(gòu)建了藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化學(xué)成分為木犀草素、刺槐素、光甘草定、甘草查爾酮B、豆甾醇。木犀草素、刺槐素是桔梗的活性成分，光甘草定、甘草查爾酮B、豆甾醇是杏仁的活性成分。其中木犀草素在網(wǎng)絡(luò)中的Degree值(50)遠(yuǎn)超其他化學(xué)成分(刺槐素21、光甘草定16、甘草查爾酮B15、豆甾醇 14)，可推斷是“杏仁-桔?！彼帉?duì)在治療急性支氣管炎中發(fā)揮療效的最關(guān)鍵成分。

木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性作用。木犀草素的抗炎作用主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)(抑制IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα、IFN-β等促炎因子，提高IL-10等抑炎因子的水平，并抑制趨化因子)和改變NF-κB、MAPK等信號(hào)通路來(lái)完成[14]。據(jù)現(xiàn)有研究顯示，木犀草素對(duì)金黃色葡萄球菌[15]、化膿隱秘桿菌[16]等革蘭氏陽(yáng)性菌，H1N1[17]、COVID-19[18]、EV71[19]等病毒均有一定抑制效果。刺槐素、光甘草定與木犀草素同屬黃酮類，藥理活性有一定相似之處，同樣具有良好的抗炎殺菌活性[20-21]。實(shí)驗(yàn)證明，刺槐素可以降低過(guò)敏性哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺組織杯狀細(xì)胞增多[22]，并對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌都具有很強(qiáng)的抑制活性[23]，對(duì)流感病毒也有一定抑制作用[24]。光甘草定除對(duì)結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等有良好的抗菌活性外[25]，還可誘導(dǎo)白色念珠菌的凋亡[26]。甘草查爾酮B可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[27]。豆甾醇屬植物甾醇類，亦有顯著的抗炎活性，已被證實(shí)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎[28]、結(jié)腸炎[29]等有一定治療效果。由此可見(jiàn)，“杏仁-桔?！敝械亩喾N主要化學(xué)成分均有明確的抗炎、抗菌、抗病毒等作用，適用于急性支氣管炎的臨床治療。

藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析顯示：前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1(PTGS1)、維甲酸X受體α(RXRA)、β2腎上腺素能受體(ADRB2)等Degree值較高，是治療急性支氣管炎的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。PTGS又稱環(huán)氧化酶(COX)，能夠分解花生四烯酸產(chǎn)生各種內(nèi)源性前列腺素，PTGS2是誘導(dǎo)型酶，受到炎癥刺激時(shí)，其表達(dá)水平顯著升高，在哮喘患兒中，氣道黏膜中的單核-巨噬細(xì)胞等可激活產(chǎn)生大量的PTGS2，其可進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，加重氣道的炎癥反應(yīng)，引起呼吸困難[30]。PTGS1是結(jié)構(gòu)型酶，在機(jī)體中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，主要功能是促進(jìn)生理性前列腺素的合成。RXRA是配體依賴的核受體家族的重要成員,在炎癥反應(yīng)和代謝障礙中可能占據(jù)著至關(guān)重要的地位[31]。ADRB2屬于鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體，主要存在于支氣管上皮、肺部免疫細(xì)胞中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)β2腎上腺素能激動(dòng)劑的活性，抑制氣道平滑肌細(xì)胞的增殖以及炎性細(xì)胞的積累，在調(diào)控氣道高反應(yīng)和COPD的發(fā)展中扮演非常重要的角色[32]。由此可見(jiàn)，“桔梗-杏仁”藥對(duì)可通過(guò)作用于PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2等靶點(diǎn)來(lái)改善呼吸道炎癥。

基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)，得到AKT1、TP53、MAPK1等是起到橋梁作用的核心靶點(diǎn)。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，也是PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面扮演著重要角色[33]，可影響肺部及氣道炎癥[34]。TP53是一種腫瘤抑制因子，可調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞感染結(jié)核分歧桿菌的研究中，TP53協(xié)同p300抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化，負(fù)調(diào)控TNF-α等炎癥因子的分泌[35]。絲裂原活化蛋白激酶MAPK1又稱細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK2，ERK1/2被激活后能介導(dǎo)多種生長(zhǎng)因子和炎癥介質(zhì),調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞的增殖, 從而參與氣道炎癥和氣道重塑[36]。

根據(jù)GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，杏仁-桔梗藥對(duì)作用靶點(diǎn)顯著富集于細(xì)胞凋亡、PI3K-Akt、TNF以及T細(xì)胞受體等信號(hào)通路，發(fā)揮調(diào)控凋亡、細(xì)胞增殖、一氧化氮合成等生物學(xué)功能。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡，氣道上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡，可破壞氣道上皮完整性，進(jìn)而破壞氣道局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[37]。PI3K-Akt信號(hào)通路是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化調(diào)節(jié)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在炎癥、腫瘤、代謝等相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[38]。有實(shí)驗(yàn)證明，激活PI3K/Akt信號(hào)通路可誘導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)呼吸道上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[39]。TNF-α與TNFR2結(jié)合可激活NF-κB信號(hào)通路,產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)，增加炎癥因子對(duì)氣道的浸潤(rùn)，造成氣道高反應(yīng)[40]。T淋巴細(xì)胞是調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞群，其中CD4+/CD8+是衡量免疫功能重要指標(biāo)，支氣管哮喘患者CD4+/CD8+明顯下降[41]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，試對(duì)“杏仁-桔?！彼帉?duì)治療急性支氣管炎的多種作用靶點(diǎn)、作用通路及潛在機(jī)制做出探討，為今后的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，“杏仁-桔?！敝械哪鞠菟?、刺槐素、光甘草定、甘草查爾酮B、豆甾醇等主要活性成分可能通過(guò)細(xì)胞凋亡、PI3K-Akt、TNF、T細(xì)胞受體等信號(hào)通路作用于PTGS2、PTGS1、AKT1、TP53等關(guān)鍵靶點(diǎn)，來(lái)發(fā)揮其抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用。曾有研究提出，“杏仁-桔梗”藥對(duì)用于止咳、祛痰的最佳比例分別為1∶1和1∶2[42]，而此次研究未能將藥對(duì)之間的劑量配比納入考慮范圍，具有一定局限性。希望今后能有更完善的理論及實(shí)驗(yàn)研究和臨床療效觀察來(lái)對(duì)以上結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，為“杏仁-桔?！敝委熀粑兰毙匝装Y提供更有效的依據(jù)。