孫麗艷，楊賓烈，張 愛，原杰彥，陶萍萍

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201200 )

宮頸癌是導致全球范圍內(nèi)女性死亡的第四大原因，僅中國就有13.5萬例新病例登記在案，其中死亡病例占發(fā)病人數(shù)的50 %左右[1,2]。人乳頭狀瘤病毒(HPV)是感染宮頸癌最重要的危險因素[3]，其中HPV16 E6過表達可使腫瘤蛋白53(p53)和視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)失活阻礙細胞凋亡，誘導細胞增殖及抑制細胞凋亡[4-8]。有研究表明，HPV16 E6變異對宮頸癌發(fā)展進程有重要影響，尤其是HPV16 E6 L83V(T350G)突變能可通過降解p53加速宮頸癌的惡化[9]，然而其分子機制還未明確。有研究表明，受體酪氨酸激酶B(TrKB)在惡性腫瘤的形成和轉移中起著重要的作用，TrKB與其配體腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的結合可促進上皮間質轉化、細胞增殖等過程，并且可激活磷脂酰肌醇3激酶/絲/蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)通路[11]，進而活化鼠雙微體2(MDM2)，MDM2作為p53的負性調(diào)節(jié)因子可使p53失活[12,13]。本課題前期研究已表明HPV16 E6基因中的T178G、T350G和A442C變異與HPV16持續(xù)感染有關，并且HPV16 E6 T350G可能有更高的錐切術后HPV16復發(fā)及持續(xù)感染相關性[13-15]。此外，TrKB和BDNF在宮頸癌及癌旁組織中的表達呈顯著差異[16,17]，以及初步探索了HPV16 E6與p53、Rb的表達關系[18,19]。綜上所述，根據(jù)前期研究及已有報道，筆者提出HPV16 E6 T350G對宮頸癌進程的調(diào)控可能通過調(diào)控BDNF/TrkB表達，以及影響PI3K/AKT信號通路及下游分子p53表達有關，并且目前沒有文章表明上述分子之間的靶向調(diào)控關系，因此本課題具有一定的創(chuàng)新性。本課題將通過組織檢測與體外實驗，探究HPV16 E6變異對宮頸癌細胞增殖能力的影響及相關分子機制。本項目的實施將為臨床治療宮頸癌提供一定的理論基礎，具有重要的理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人宮頸上皮細胞(HCerEpiC)(中國科學院上海細胞生物學研究所)、LV5-HPV 16 L83V(T350G)過表達慢病毒(生工生物工程(上海)股份有限公司)、AKT抗體(Abcam)、p-AKT抗體(Abcam)、p-PI3K抗體(Abcam)、PI3K抗體(Abcam)、TrKB抗體(Abcam)、BDNF抗體(Abcam)、羊抗兔IgG(Abcam)、內(nèi)參抗體GAPDH(Abcam)、內(nèi)參抗體β-actin(Abcam)、ECL發(fā)光液(7 Sea biotech)、TRIpure總RNA提取試劑(北京百泰克)、Super M-MLV反轉錄酶(北京百泰克)、酶標儀(ELX-800，BIOTEK)、熒光定量PCR儀(Exicycler 96，BIONEER)、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天)、—70℃超低溫冰箱(DW HL-668)、引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 宮頸癌組織標本

收集上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院2017年4月～2018年2月宮頸浸潤癌IA 1期～IB 2期行廣泛全子宮切除術后宮頸組織10例和因宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(CIN Ⅱ)行LEEP術切除宮頸組織10例，患者35～63歲，中位年齡51歲，術前均未接受放化療。標本組織經(jīng)過3位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師進行診斷，所有患者經(jīng)書面知情同意參與本研究。且通過醫(yī)院倫理委員會批準。標本收集后于-80 ℃冰箱保存。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

HCerEpiC細胞用含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。調(diào)整HCerEpiC細胞狀態(tài)，HPV16 E6 T350G慢病毒過表達載體(pLV5-HPV16 E6 T350G)及對照(pLV5-vector)，選擇對數(shù)生長期細胞進行轉染，以HCerEpiC細胞(control)作為對照。

1.4 Real-time PCR

稱取30～100 mg宮頸癌組織及CINⅡ宮頸組織，液氮冷凍后進行研磨操作，利用總RNA提取試劑及cDNA合成試劑提取細胞總RNA并反轉錄至cDNA，放入ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量反應，采用2-△△CT法對ECRG4 mRNA進行定量分析。引物序列如下，β-actin-F:5'-GGAAATCGTGCGTGACATC AA-3'，β-actin-R：CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA；HPV16 E6 T350G-F:5'-TATAAAACTAAGGGCGTAAC-3'，HPV16 E6 T350G-R:5'-CATGCAATGTAGGT GTATCT-3';BDNF-F:5'-TGCGGGAGGAATTTCTGAGT-3'，BDNF-R: 5'-CTTAA AGCACGAGGTCC-3';TrKB-F:5'-CTGGCCTGGAATTGACGATG-3',TrKB -R：5'-ACCACAGCATAGACCGAGAG-3';p53-F:5'-TGCGTGTGGAGTATTTGATG- 3',p53-R:5'-TGGTACAGTCAGAGCCAACCTC-3'。

1.5 Western Blot

取各組細胞，提取蛋白，繪制蛋白標準曲線。取15～30 μg進行SDS-PAGE電泳。轉PVDF膜后，封閉后加入一抗(兔抗BDNF、TrKB、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT均1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后，加入二抗(羊抗兔IgG-HRP，1∶10 000稀釋)37 ℃孵育40 min。孵育ECL發(fā)光液，靜置5 min，暗室曝光后顯影、定影，掃描膠片采集灰度值，分析目標條帶光密度值。

1.6 MTT細胞增殖實驗

細胞轉染后，將濃度為0.2 mg/mL MTT，96孔板每孔加入20 μL，每組設置3個副孔，同時設置空白孔。培養(yǎng)4～6 h，棄上清，每加入150 μL DMSO，水平搖床上震蕩，formazan結晶顆粒全部溶解后停止。570 nm測定吸光度，存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100 %。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 CINⅡ宮頸組織與宮頸癌組織各基因mRNA表達檢測結果

Real-time PCR實驗結果表明與CINⅡ宮頸組織相比，宮頸癌組織中HPV16 E6 T350G表達呈陽性，以及TrKB與BDNF mRNA表達也呈明顯上調(diào)趨勢(P<0.01)，此外p53表達呈陰性(P<0.01)。見表1。

表1 CINⅡ宮頸組織與宮頸癌組織中相關基因表達量的比較

2.2 HPV16 E6 T350G基因過表達結果

將HPV16 E6 T350G慢病毒表達載體(pLV5-HPV16 E6 T350G)及空載體對照(pLV5-vector)轉染HCerEpiC細胞后，Real-time PCR結果表明pLV5-HPV16 E6 T350G組細胞中HPV16 E6 T350G mRNA水平(6.92±0.10)與pLV5-vector組(1.08±0.02)相比顯著上調(diào)(P<0.01)，表明轉染實驗成功，可用于后續(xù)實驗。

2.3 HPV16 E6 T350G對HCerEpiC細胞BDNF/TrKB表達的影響

將pLV5-HPV16 E6 T350G及pLV5-vector轉染HCerEpiC細胞后，Real-time PCR及Western Blot結果表明，HPV16 E6 T350G在HCerEpiC細胞中表達上調(diào)后，會顯著增強BDNF與TrKB mRNA及蛋白表達水平(P<0.01)，表明在宮頸癌中BDNF/TrKB可能作為HPV16 E6 T350G變異的下游調(diào)控分子。見表2。

表2 HPV16 E6 T350G對各組細胞BDNF/TrKB mRNA及蛋白表達量的影響

2.4 HPV16 E6 T350G對HCerEpiC細胞PI3K/Akt信號通路及p53表達的影響

將pLV5-HPV16 E6 T350G及pLV5-vector轉染HCerEpiC細胞后，Western Blot結果表明，HPV16 E6 T350G在HCerEpiC細胞中表達上調(diào)后，會上調(diào)PI3K與Akt 磷酸化水平(P<0.01)，說明HPV16 E6 T350G可能通過BDNF/TrKB激活宮頸癌細胞中PI3K/Akt信號通路。此外，Real-time PCR實驗結果表明HPV16 E6 T350G的上調(diào)能夠明顯降低p53表達水平(P<0.01)。見表3。

表3 HPV16 E6 T350G對各組細胞PI3K/Akt信號通路及p53表達的影響

2.5 HPV16 E6 T350G對HCerEpiC細胞增殖能力的影響

將pLV5-HPV16 E6 T350G及pLV5-vector轉染HCerEpiC細胞后，MTT實驗結果表明HPV16 E6 T350G的過表達能夠增強HCerEpiC細胞的增殖能力。見表4。

表4 HPV16 E6 T350G對各組細胞增殖能力的影響

3 討論

宮頸癌作為全球范圍內(nèi)高發(fā)病率婦科惡性腫瘤之一，嚴重影響女性的正常生活及身心健康。HPV作為感染宮頸癌的重要因素，其變異對宮頸癌的發(fā)展起著不可忽視的作用[5]。HPV是具有雙鏈環(huán)狀基因組的非胞膜DNA病毒，包含6個早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和兩個晚期基因(L1、L2)[6,20]。HPV家族根據(jù)DNA序列同源性可分為5個屬，其中α屬(α-HPV)中的高風險α-HPV(HR-HPVS)是宮頸癌與肛門生殖器癌等疾病的致病因子。因HPV感染引起的99.7 %宮頸癌中，HR-HPVS是引起宮頸感染的主要原因，其中HPV16引發(fā)的感染占50 %，HPV16的E6與E7蛋白過度表達可通過引起細胞調(diào)節(jié)蛋白p53和Rb的失活阻礙細胞凋亡，誘導細胞增殖及轉化[4-8]。其中，HPV16 E6變異在宮頸癌相關研究中被廣泛關注，并且HPV16不同變異體育宮頸腫瘤癌變的相關性各不相同。HPV16變異體可分為歐洲型(E)、亞洲型(As)、亞美型(AA)和非洲型(Af)[21]。研究表明HPV16 E6氨基酸位點中的L83V(T350G)突變，被認定是HPV16使宮頸病變組織惡化的重要因素之一。此外，有研究表明HPV16 L83V 能加速p53的Bax蛋白降解從而抑制細胞凋亡能力，加強與E6結合蛋白(E6-BP)的結合能力[9]。

TrKB是一種跨膜蛋白，是BDNF的特異性受體，越來越多的證據(jù)表明TrKB在一些惡性腫瘤的形成和轉移中起著重要的作用，TrKB可與其配體BDNF結合誘導多種信號級聯(lián)，包括PI3K/AKT途徑[22-24]。PI3K/AKT通路已成為多種抗癌藥物耐藥的主要驅動因素，p53作為其下游分子，該通路的激活可使p53失活，進而促進細胞的增殖能力，是癌細胞逃避程序性細胞死亡的常見機制[12,13]。

本研究結果表明，與CINⅡ宮頸組織相比，宮頸癌組織中HPV16 E6 T350G表達呈上調(diào)趨勢，BDNF及TrKB也同樣表達上調(diào)，說明在宮頸癌細胞中HPV16 E6 T350G可能通過增強BDNF/TrKB表達來影響宮頸癌發(fā)展進程。隨后，通過在HCerEpiC細胞中過表達HPV16 E6 T350G，同樣可以達到上調(diào)BDNF與TrKB mRNA及蛋白水平的結果。此外，筆者對BDNF/TrKB下游PI3K/AKT信號通路進行檢測，結果表明，HPV16 E6 T350G的過表達可使PI3K與AKT磷酸化水平增高，說明HPV16 E6 T350G可使PI3K/AKT信號通路激活。最后，HPV16 E6 T350G的過表達可使p53表達下調(diào)，以及可以增強HCerEpiC細胞的增殖能力，該結果進一步闡明HPV16 E6 T350G對宮頸癌發(fā)展進程的影響。

綜上所述，在宮頸癌細胞中HPV16 E6 T350G可能通過上調(diào)BDNF/TrKB表達促進PI3K/AKT信號通路的激活，使p53失活增強細胞增殖能力，進而促進宮頸癌疾病的發(fā)展與惡化。本研究明確了HPV16 E6 T35G基因變異對宮頸癌增殖的影響及其分子機制，為HPV16 E6 T350G在宮頸癌發(fā)展中的作用提供新的證據(jù)與靶點。