李 揚 王 云 李 遵 朱朝陽

河南大學(xué)淮河醫(yī)院泌尿外科，河南省開封市 475000

膀胱癌是臨床泌尿外科最常見的腫瘤之一，給患者的生命造成很大的威脅。世界上每年新發(fā)膀胱癌病例約200 000例，在美國，膀胱癌發(fā)病率居于常見惡性腫瘤的第4位，而女性膀胱癌患者的發(fā)病率約為男性患病率的25%[1]。在中國，膀胱癌發(fā)病率居所有泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之首，亦為男性患者居多，且上皮細胞源性腫瘤居多，占所有膀胱癌的95%以上，而尿路上皮癌(urothelium)占90%以上，腺癌以及鱗狀細胞癌相對少見[2]。雖然膀胱癌發(fā)病率較高，但其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制并不完全清楚。因此，隨著細胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的快速發(fā)展，產(chǎn)生了關(guān)于腫瘤免疫治療、特異基因靶點的基因治療以及RNAi干擾技術(shù)的產(chǎn)生，為更好診治膀胱腫瘤展現(xiàn)了新的前景。研究發(fā)現(xiàn)新的膀胱癌分子標志物將為膀胱癌關(guān)于基因診斷與治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 miR-218靶基因預(yù)測及Robo1表達水平分析 采用微小RNA在線靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)在線預(yù)測miR-218潛在作用靶點，其預(yù)測機制為miR-218序列與靶基因3’-UTR區(qū)域靶向結(jié)合。分析顯示，Robo1基因mRNA 3’-UTR區(qū)可與miR-218靶向結(jié)合。在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析Robo1在多種腫瘤中的表達水平，及其與膀胱癌患者的臨床分期關(guān)系。

1.2 Robo1突變分析 在用TCGA在線分析工具cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)對Robo1的在膀胱癌及多種實體腫瘤中的突變情況進行分析。包括突變種類、突變頻率及對應(yīng)的突變位置。

1.3 Robo1相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及KEGG信號通路分析 在STRING數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建Robo1相關(guān)基因表達的蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建條件為：相互作用來源為實驗、共表達、數(shù)據(jù)庫、基因融合等；最小相互作用評分為0.07，相互作用蛋白不超過20個。同時在KEGG數(shù)據(jù)庫中(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)，對相互左右的蛋白網(wǎng)絡(luò)進行信號通路富集。

1.4 Robo1表達與患者預(yù)后 根據(jù)Robo1表達水平，分為高、低表達組(高表達組：Robo1基因mRNA表達水平≥腫瘤組織中的中未表達數(shù)；低表達組：Robo1基因mRNA表達水平<腫瘤組織中的中未表達數(shù))，比較兩組患者無疾病進展生存(DFS)和總生存(OS)是否存在差異。高、低表達組生存比較采用log-rank檢驗。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用Stata12.0軟件完成，相關(guān)基因表達、預(yù)后、突變等分析采用在線數(shù)據(jù)分析工具，雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-218靶向 Robo1及Robo1表達水平分析 Targetscan微小RNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)miR-218能與Robo1基因3’-UTR靶向結(jié)合，從而抑制Robo1基因的表達(圖1a)。TCGA數(shù)據(jù)中顯示Robo1在多種腫瘤中表達水平變化不顯著，在膀胱癌患者癌組織和癌旁組織中Robo1基因mRAN表達水平并無顯著差異(圖1b)，其表達水平與患者分期也無相關(guān)性(P>0.05)，見圖1c。

圖1 miR-218靶向 Robo1及Robo1表達水平分析

2.2 Robo1突變水平分析 Robo1基因主要突變形式為融合突變、擴增突變、深度缺失突變，具體突變位置見圖2。

圖2 Robo1基因突變水平及位置分析

2.3 Robo1相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)及信號通路富集 STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建Robo1相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有21個相關(guān)基因，基因間的聯(lián)系為75，平均節(jié)點相關(guān)度為7.14，區(qū)域聚類指數(shù)為0.77，相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)富集明顯(P<0.001)，見圖3。 蛋白網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因KEGG信號通路主要富集于Ras信號通路、Rap1信號通路及cGMP-PKG信號通路等，見表1。

圖3 Robo1基因相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

表1 Robo1相關(guān)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)KEGG信號通路富集

2.4 Robo1表達與患者預(yù)后 Robo1高低表達膀胱癌患者DFS和OS間均存在明顯的差異(P<0.05)。DFS(HR=1.40,P=0.044)和OS(HR=1.40,P=0.037)在Robo1高表達組患者顯著低于低表達組，提示Robo1高表達是膀胱癌預(yù)后不良的因素，見圖4。

圖4 Robo1表達與膀胱癌患者生存期分析

3 討論

Roundabout蛋白，也稱為Robo受體，為一種跨膜蛋白受體。有四種Robo受體在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，分別為Robo1、Robo2、Robo3、Robo4[3-4]。成熟個體的多數(shù)組織和器官中均可表達Robo1與Robo2，但在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)表達明顯，Robo3僅表達于發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而Robo4則主要表達于內(nèi)皮細胞中。以往研究表明，Robo可在胰腺癌、卵巢癌及口腔癌中表達[5-6]。Robo1和Robo4可廣泛表達于卵巢癌組織和細胞胞漿中，且與卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。鑒于現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實，Robo基因與肝癌、直腸癌等多種腫瘤的病理有關(guān)，因此，我們有理由推測Robo基因也可能與膀胱癌的病理有關(guān)。鑒于文獻檢索顯示，尚未有Robo基因與膀胱癌病理方面的研究結(jié)果，因此，開展本研究以揭示膀胱癌發(fā)生的病理及尋找關(guān)鍵的分子標志物，尋找膀胱癌治療的新方法、新靶點。

在本研究中，我們采用生物信息學(xué)分析方法，證實了Robo1基因在膀胱癌等多種腫瘤中存在突變，并在膀胱癌等的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮作用。Robo1表達水平與患者預(yù)后有關(guān)，高表達膀胱癌患者預(yù)后較差，總生存和無疾病進展生存均較低。提示其表達可作為膀胱癌患者預(yù)后的分子標志物。同時miR-218可靶向Robo1并降低其表達水平，為開發(fā)針對Robo1的靶向藥物提供了新的潛在靶點。

但本研究也存在一定的局限性，雖然研究結(jié)果證實miR-218可靶向Robo1并降低其表達水平并可作為膀胱癌預(yù)后分子標志物和潛在靶向治療藥物開發(fā)新靶點，但其具體調(diào)控的分子機制并未完全闡明，下一步，應(yīng)采用體內(nèi)外實驗分子實驗，對上述結(jié)果進行證實，完善其分子調(diào)控機制。