何曦萌 徐黎青 朱春霖 潘小紅 何 梅 吳麗輝 孫軍剛

1 成都中醫(yī)藥大學，四川省成都市 610000； 2 四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)是嘌呤代謝異常引起的代謝性疾病。多項研究表明，高尿酸血癥不僅是痛風的重要生化基礎，也與肥胖[1]、糖代謝異常[2-3]、高血壓[4]和慢性腎臟病[5]關系密切。合適的動物模型是進一步探究其發(fā)病機制與藥物研發(fā)的基礎，但目前高尿酸血癥模型造模方法眾多、劑量各異，對實際造模操作有一定影響。文獻調(diào)研表明，高尿酸血癥小鼠模型多采用腹腔注射氧嗪酸鉀[6-10]的給藥方式構(gòu)建，但注射造模存在首過效應，血清尿酸水平升高持久性較差，且長期腹腔注射很容易造成腹腔積水、腹膜硬化等不良反應，不適于慢性高尿酸血癥模型的建立，同時因氧嗪酸鉀不溶于水，造模時常用羧甲基纖維素鈉水溶液配置成混懸劑，一般認為混懸劑不適合注射給藥。而灌胃法相對刺激輕微，可以避免這些弊端，常用于制作長期模型。因此本實驗結(jié)合嚙齒類動物存在尿酸酶代謝系統(tǒng)的特點，采用灌胃的給藥方式，給予雄性KM小鼠不同劑量的次黃嘌呤(Hypoxanthine,HX)與氧嗪酸鉀(Potassium Oxoxazine,PO)，通過小鼠造模前后空腹體重變化及血清尿酸(Serum uric acid，SUA)評價構(gòu)建動物模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物： SPF級KM雄性小鼠50只，1月齡，體重25～30g，由四川省中醫(yī)藥科學院動物中心提供[SCXK (川) 2018-19]，飼養(yǎng)在四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心[SYXK (川)2018-100]。動物飼養(yǎng)室內(nèi)以12h晝夜循環(huán)照明，溫度維持在(22±2)℃，濕度(50±10)%，自由飲水和采食。整個實驗過程中對動物的各種處置均符合中華人民共和國科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.2 試劑與儀器： 氧嗪酸鉀(Potassium Oxonate，PO，美國Sigma公司,批號SLBT3093)；次黃嘌呤(Hypoxanthine，HX，美國Sigma公司,批號SLBZ9513)；羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,成都市科龍化工試劑廠，批號030612)；尿酸由四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科進行檢測(全自動生化分析儀，西門子ADVIA2400;INS:羅氏電發(fā)光分析儀，COBAS602)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模： 適應性喂養(yǎng)1周后，小鼠禁食12～14h，飲水自由，次日測量空腹體重，乙醚麻醉后內(nèi)眥采血，檢測SUA基礎數(shù)據(jù)。按空腹體質(zhì)量將小鼠隨機分為空白組和4個模型組(A、B、C、D)，每組10只。次黃嘌呤與氧嗪酸鉀用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，每組予不同劑量灌胃。見表1。模型A、B、C組均先灌胃給予次黃嘌呤，2h后再灌胃給予氧嗪酸鉀，模型D組灌胃給予氧嗪酸鉀，空白組灌胃等體積蒸餾水，持續(xù)7d。造模期間，各組小鼠自由飲水，喂飼相同質(zhì)量的飼料。

表1 各組小鼠灌胃劑量

1.2.2 檢測指標：每天觀察小鼠的一般情況，對比造模前后小鼠空腹體重和SUA變化。第6日灌胃后予禁食14h，第7日測定空腹體重，于末次造模后2h內(nèi)眥取血，室溫靜置1～2h后2 000r/min離心15min，取血清送檢。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況 隨著造模時間的延長,模型C組出現(xiàn)體毛干枯無光澤、精神萎靡、飲食及活動減少等，其余組小鼠毛色正常、精神狀態(tài)良好，整個實驗過程，各組小鼠未出現(xiàn)死亡。

2.2 小鼠空腹體重變化 造模開始時各小組體質(zhì)量均無顯著差異，實驗期間，各組小鼠體重呈逐漸增長的趨勢，造模7d后，模型C組與空白組小鼠比較，其體重增長緩慢，差異有顯著性(P<0.05)。其余模型組與空白組比較，體重差異無顯著性，與模型C組比較，體重增長較快，差異有顯著性(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠體重比較

2.3 小鼠血清尿酸變化 造模前各小組基礎尿酸值均無顯著差異，造模7d后，只有模型C組與空白組比較SUA水平升高，差異有顯著性(P<0.001)，提示造模成功。模型B、D組造模后SUA升高，但與空白組比較無顯著性差異。模型A組造模后SUA水平反而降低，與空白組比較差異無顯著性。模型C組SUA水平均高于其余模型組，差異具有顯著性(P<0.001)。見表3。

表3 各組小鼠血清尿酸比較

3 討論

高尿酸血癥在我國的發(fā)病率日趨升高，因此建立合適的HUA模型以便開展研究成了熱點。嚙齒類動物是目前構(gòu)建高尿酸血癥采用最廣泛的實驗動物，但是其體內(nèi)存在尿酸酶，可將尿酸分解為尿囊素，然后被排出體外，造高尿酸血癥模型困難。劉曉燕等[10]研究表明，選擇高尿酸血癥在體模型時，昆明種小鼠靈敏度高于ICR小鼠以及近交系的C57BL/6J小鼠。金沈銳等[11]報道，雌雄小鼠及同性動物間SUA值差異較大，雌性小鼠個體間SUA值波動較大，建議選用雄性小鼠。

HUA模型的造模方法多樣，根據(jù)HUA的發(fā)病機制主要有直接補充尿酸合成前體物質(zhì)(腺嘌呤、次黃嘌呤等)或者外源性尿酸，給予尿酸酶抑制劑(氧嗪酸鉀)或抑制腎臟對尿酸的排泄(乙胺丁醇)等藥物，以及敲除尿酸酶Uox和轉(zhuǎn)運體ABCG2基因[12]。其中采用腺嘌呤造模，小鼠腎功能損害明顯[13-14]，更適用于高尿酸血癥伴腎衰模型的建立。氧嗪酸鉀化學結(jié)構(gòu)與尿酸的嘌呤環(huán)類似，競爭性地與尿酸酶結(jié)合，可用于復制較穩(wěn)定的高尿酸血癥，短時間內(nèi)尿酸升高，且對腎臟損害不明顯[15-16]。在國際上，以氧嗪酸鉀為誘導劑建立高尿酸血癥的方法得以廣泛使用。

基于文獻研究，本實驗選擇雄性KM小鼠，采取灌胃次黃嘌呤和氧嗪酸鉀的方式構(gòu)建高尿酸血癥模型，在四個模型組中，只有模型C組造模7d后，血清尿酸水平明顯升高，且與空白組和其余模型組之間存在顯著差異(P<0.05)，提示高尿酸血癥模型制備成功，但是小鼠出現(xiàn)體重增長緩慢、精神萎靡、飲食減少，考慮是小鼠體內(nèi)尿酸水平增加過快造成了一定程度的腎臟損傷。需要說明的是，在實踐中若要將模型動物的血尿酸升高到臨床診斷標準(420μmol/L)以上，往往會導致動物死亡，這也說明藥物性“高尿酸血癥”動物模型與臨床有較大差異。模型A組SUA均值下降，根據(jù)甘志勇等[17]研究報道尿酸濃度升高時，可能反饋性促進尿酸酶的表達或者活性增加。說明低劑量氧嗪酸鉀不足以抑制代償性增多的尿酸酶，因而出現(xiàn)后續(xù)的血尿酸降低。陳露瀅等[18]對SD大鼠每日以氧嗪酸鉀1.5g/kg灌胃15d造成SUA水平升高。本研究中模型D組使用相同劑量的氧嗪酸鉀灌胃造模，SUA有升高趨勢，但差異不顯著，可能與實驗周期略短相關。同時通過比較模型C組與模型D組KM小鼠造模后SUA水平，發(fā)現(xiàn)在灌胃造模的條件下，次黃嘌呤和氧嗪酸鉀聯(lián)用造模效果更好，說明了藥物聯(lián)用具有造模優(yōu)勢。

綜上所述，本實驗采用灌胃給藥的方式作用于KM雄性小鼠，500mg/kg次黃嘌呤聯(lián)合1 000mg/kg氧嗪酸鉀可用于制備高尿酸血癥小鼠模型，但對小鼠體質(zhì)量有一定影響，同時也進一步驗證了藥物聯(lián)用具有造模優(yōu)勢，為制備HUA小鼠模型提供了參考依據(jù)。但仍有很多亟待解決的問題，如小鼠與人體尿酸代謝機制存在差異，造模所致的腎損傷尚無定論等，需要后期進一步的優(yōu)化與探討。