楊宜英，曾泓杰，王征

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州510150）

全球大概10%～15%夫婦受不孕不育影響，其中因男性因素不育占50%左右［1］。父本DNA 異常會影響輔助生殖的成功率和胚胎質(zhì)量、影響胚胎發(fā)育從而導(dǎo)致胚胎停育［2］。此外精子DNA 損傷與先天畸形及兒童疾病甚至兒童癌癥關(guān)系密切。有研究表明精子DNA 損傷比傳統(tǒng)精液質(zhì)量對疾病有更好的診斷及預(yù)后意義［3］。

傳統(tǒng)的精液分析與技師經(jīng)驗有關(guān)，質(zhì)量控制難，結(jié)果不穩(wěn)定，變異系數(shù)大。而且不育男性與正常男性的參數(shù)范圍有很大的重疊。由于精子是高度專業(yè)化的細胞，精液分析只能評估精子某些方面的損傷及生殖功能部分完整性，無法直接測量精子的染色體損傷。已開發(fā)各種檢測來評估精子的完整性從而反映精子損傷的程度，主要包括精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測定（SCSA）、精子染色質(zhì)分散測定、單細胞凝膠電泳或彗星測定測定、吖啶橙測試等［4-5］。相比標(biāo)準(zhǔn)精子參數(shù)（濃度，活力和形態(tài)），精子DNA 完整性具有更好的診斷和預(yù)后能力［6］。

精漿彈性蛋白酶是機體內(nèi)水解彈性蛋白的酶，主要來源于白細胞。當(dāng)生殖道感染時，由于精液白細胞增加，精漿蛋白酶也隨之升高。普遍將精液中彈性蛋白酶＞1 000 ng/mL 定義為確診感染。有報道稱精漿彈性蛋白酶濃度可以反映生殖道炎癥情況，并與精子質(zhì)量相關(guān)并提示不孕［7-8］。然而也有報道發(fā)現(xiàn)不育患者的血液及精液中彈性蛋白酶含量與精液常規(guī)參數(shù)無相關(guān)性［9］。因此其含量與精子質(zhì)量的關(guān)系還不明確。本研究采用吖啶橙染色結(jié)合流式細胞儀的方法檢測男性患者精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）、精子成熟度（HDS）；測定了精子活力、總數(shù)、濃度等精液分析參數(shù)及患者臨床特征指標(biāo)。主要研究目的包括衡量傳統(tǒng)精液分析參數(shù)與精子碎片率指數(shù)的結(jié)果一致性及相關(guān)性，并進一步研究影響精子碎片率的臨床因素。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2020 年12 月至2021 年3 月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖科就診的男性患者標(biāo)本142例。年齡在25～51 歲，中位數(shù)為34 歲，所有精液標(biāo)本馬上進行精液分析檢測或精液完整性檢測，無抗凝劑4 000 g 離心10 min 分離血清并分裝2 份于-20 ℃?zhèn)溆?。并對其進行乙肝表面抗原檢測。EDTA抗凝劑全血標(biāo)本用于檢測糖化血紅蛋白。該研究由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號為：2019007。所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 儀器設(shè)備

BD 流式細胞儀、離心機、酶標(biāo)儀、BD 自動生化分析儀、雅培I2000 化學(xué)發(fā)光儀。

1.3 試劑與耗材

化學(xué)發(fā)光法檢測試劑ARCHITECTR HBsAg 購自雅培公司；精漿彈性硬蛋白酶（酶聯(lián)免疫法）購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；精子核完整性染色試劑購自浙江星博生物科技有限公司；糖化血紅蛋白試劑購自Tosoh 公司。

1.4 研究方法

1.4.1精液質(zhì)量分析 研究對象禁欲2～7 d，手淫法獲取精液，精液標(biāo)本保存在無菌取精杯中，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)，待其液化后進行精液常規(guī)檢查。根據(jù)第五版WHO 手冊，將精子濃度≥15×106/mL，精子總數(shù)≥39×106，精子前向運動≥32%，總活力≥40%，正常精子形態(tài)≥4%，認定為正常精液參數(shù)參考范圍。

1.4.2精子DFI 及HDS 的檢測 根據(jù)精子核完整性染色試劑說明書（浙江星博生物科技），采用吖啶橙染色法配合流式細胞術(shù)檢測精子的碎片率及成熟度并計算結(jié)果。精子DFI 反映受損精子的比例及精子完整性。操作方法如下：新鮮樣本室溫液化30 min 后，顯微鏡觀察計數(shù)，根據(jù)計數(shù)的精液濃度，取一定量精液用A 液稀釋至100 μL，終濃度為1×106/mL～2×106/mL 的精子細胞；在流式細胞儀進樣管中加入100 μL 稀釋好的樣本，再加入200 μL 的B液（置于冰上操作），準(zhǔn)確計時30 s 后，加入600 μL的C 液；流式細胞儀平衡樣品線后檢測樣品，測定至少5 000 個細胞記錄并統(tǒng)計。將標(biāo)本按照DFI 結(jié)果分為3 組，分別為精子低碎片率組（組1）：DFI＜15%；精子中等碎片率組（組2）：DFI（15%～30%）及精子高碎片率組（組3）：DFI ＞30%。有研究將DFI＞30%定為精子完整性異常［10］。

1.4.3糖化血紅蛋白（HbA1c）及乙肝表面抗原（HBsAg）的檢測 全血糖化血紅蛋白含量使用羅氏自動生化儀及Tosoh G7 試劑進行測量。采用高效液相色譜（HPLC）分析HbA1c 含量。采用雅培I2000 對血清標(biāo)本中血清HBsAg 含量進行檢測，結(jié)果S/CO≥0.05 為陽性。

1.4.4精漿彈性硬蛋白酶的檢測 將液化后的精液2 000 g 離心10 min，按試劑說明書采用酶聯(lián)免疫法檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線及精液中彈性硬蛋白酶的含量，最后在450 nm/630 nm 雙波長檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本吸光度并計算。結(jié)果＞1 000 ng/mL 為陽性，臨床意義為確定感染。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 及R 軟件3.6.3 版本進行統(tǒng)計分析及作圖，韋恩圖采用R 軟件的Venn 包進行可視化繪制。計量資料首先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。本實驗的變量不符合正態(tài)分布，因此用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，采用Kruskal-Wallis 進行非參數(shù)方差分析檢驗；采用Wilcoxon rank sum test 進行兩組比較。兩組間乙肝表面抗原陽性率采用Fisher 精確檢驗；兩組間精漿彈性硬蛋白酶陽性率進行卡方檢驗。采用Spearman 的相關(guān)系數(shù)（r）用于非參數(shù)變量間相關(guān)性分析并用R 語言corrplot 包進行可視化。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同精子損傷程度組間的臨床參數(shù)及精液常規(guī)結(jié)果比較

將142 例男性精液及血液標(biāo)本按照不同DFI 比例分為3 組：DFI＜15%組1（n=52，33.5 歲）；DFI（15%～30%）為組2（n=69，34 歲）；DFI＞30%為組3（n=21，36 歲）。從表1 可見，組2 的糖化血紅蛋白水平高于組1，在DFI＜30% 的前提下，高的血紅蛋白水平可能與精子損傷有關(guān)。結(jié)果顯示，精子總數(shù)、濃度、前向運動力、總活力和正常形態(tài)隨著DFI 的升高而降低。

表1 不同亞組臨床及精液參數(shù)分析

另一方面，表2 顯示在組1 中，精液參數(shù)正常的比例為56%（29/52），組2 精液參數(shù)正常樣本比例為35%（24/69），組3 精液參數(shù)正常的比例14%（3/21）。值得注意的是，在精液分析參數(shù)正常的樣本里，有11%（3/56）的患者DFI 異常高（＞30%）。另外在精液參數(shù)異常的患者中，21%（18/86）患者的DFI 指數(shù)＞30%，73%（63/86）患者DFI%＞15%。其中前向動力與精子碎片率關(guān)系，如圖1 所示。

圖1 韋恩圖比較精液前向動力與不同精子碎片率的結(jié)果

表2 不同精子碎片率的精液常規(guī)結(jié)果的比較

2.2 精子DFI 指數(shù)與精液分析參數(shù)及臨床參數(shù)相關(guān)性分析

圖2 結(jié)果顯示精子碎片率指數(shù)與年齡、糖化血紅蛋白水平、HDS 呈正相關(guān)；并與精液體積、總精子數(shù)量、濃度、前向運動力、精子總活力及正常形態(tài)呈負相關(guān)。

圖2 精子損傷指數(shù)及精液、臨床參數(shù)相關(guān)性

2.3 不同DFI 間糖化血紅蛋白水平分析

糖化血紅蛋白顯示過去2～3 個月的平均血漿葡萄糖水平。已有文獻報道高血糖與活性氧（reactive oxygen species，ROS）、炎癥水平相關(guān)。而POS 與炎癥是精子損傷的主要誘因。如圖3 所示，在精子中度（組2）患者的糖化血紅蛋白水平高于精子低損傷組（組1），P＜0.05。

圖3 精子損傷指數(shù)及精液、臨床參數(shù)相關(guān)性

3 討論

在本研究中，我們通過吖啶橙染色檢測精子完整性反映精子碎片率及精子質(zhì)量，并證明了精子碎片率與傳統(tǒng)的精液參數(shù)（精子濃度，前向運動力，和形態(tài)等）的關(guān)系。我們觀察到精子DNA 完整性與精子前向運動相關(guān)性最強，其次是總活力、總精子數(shù)，這與之前研究結(jié)果一致［11］。精子DNA 損傷的確切機制尚不明確，但有幾種可能性，包括氧化應(yīng)激，染色質(zhì)堆積異常并且中止凋亡。過剩的ROS 會導(dǎo)致染色質(zhì)交聯(lián)，DNA 鏈斷裂，脂質(zhì)過氧化并啟動細胞凋亡信號通路［12］。有效的補充抗氧化劑及改變生活方式被認為是有效的改善精子質(zhì)量的方法。

此外我們還研究了精子碎片率與糖化血紅蛋白之間的關(guān)系，近來也有研究表明糖尿病和肥胖可以影響精子質(zhì)量，但此方面研究還存在矛盾［13-15］。在我們研究中，DFI 值在15%～30%的糖化血紅蛋白水平顯著高于DFI＜15%的精子的糖化血紅蛋白水平。說明在一定范圍內(nèi)（DFI＜30%），精子碎片率水平隨著DFI 升高而升高。但在高DFI 組（DFI＞30%）的糖化水平并沒有比前兩組更高，說明高碎片組的精子質(zhì)量可能與血糖以外因素有關(guān)。另一方面，由于糖化血紅蛋白的值與血糖比變異系數(shù)更小，也是影響研究血糖指數(shù)與精子碎片率關(guān)系的因素之一。以往在研究中也有報道糖尿病及高血糖可以提高不孕的風(fēng)險，其可能的原因包括高血糖觸發(fā)的炎癥、ROS氧化應(yīng)激、進而引起DNA 結(jié)構(gòu)變化等［16-18］。下一步，我們將納入更大人群，血糖水平及相關(guān)的隨訪來進一步研究血糖、體重指數(shù)及精子質(zhì)量的關(guān)系。

在測定方法上，吖啶橙染色對輔助生殖的預(yù)測價值文獻報道結(jié)果并不一致，部分原因可能是其傳統(tǒng)的玻片染色方法熒光發(fā)光不穩(wěn)定，并且和技術(shù)員的主觀判斷影響。在我們研究中采用的是染色與流式細胞儀結(jié)合的方法可以規(guī)避這些問題。此外，精子碎片率指數(shù)目前沒有統(tǒng)一的參考范圍，有文獻通過生育率等指標(biāo)將不同方法得到的精子碎片率閾值設(shè)為25%～30%不等［19］，還有研究將納入對象精子碎片率的中位數(shù)（14%，彗星實驗）作為參考閾值，在我們研究的人群中采用吖啶橙方法得到精子碎片率的中位數(shù)為17%，和研究結(jié)果接近［20］。由于受精成功率及胎兒出生率受影響較多，而精子質(zhì)量只是影響其成功率的一個方面。在此研究中我們并沒有調(diào)查精子碎片率與試管出生率之間的關(guān)系。在之后的研究中需要在男科和婦科學(xué)科之間進行更多合作并結(jié)合精子基因組完整性的起因和影響進行進一步研究，以此確定更加精確的精子碎片率的診斷值。

綜上，我們根據(jù)本實驗室的數(shù)據(jù)結(jié)果，探討了精子碎片率與精液分析參數(shù)的相關(guān)性，并分析了影響精子完整性的潛在臨床因素，可以幫助臨床綜合判斷患者精子質(zhì)量并采取更個性化的治療方案。