黃霜，陳芳，陳素琴

（1.廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州511400；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東 廣州510080）

隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，越來越多的技術(shù)可以應(yīng)用于產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷，不同技術(shù)有各自的特點(diǎn)，各有優(yōu)勢(shì)，可以相互取長補(bǔ)短，但并無法完全相互替代［1-2］。本文報(bào)道一例產(chǎn)前診斷中聯(lián)合應(yīng)用多種檢測(cè)方法檢測(cè)出的嵌合型21q 部分三體病例。

1 對(duì)象與方法

1.1 患者臨床資料

胎兒父母年齡分別為32 歲和31 歲，本次妊娠為第二次懷孕，自然懷孕，12 周NT：0.9mm，早期唐氏篩查21 三體風(fēng)險(xiǎn)1：381，臨界風(fēng)險(xiǎn)，于14+w 進(jìn)行孕婦外周血胎兒游離DNA 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT），結(jié)果提示：21 三體高風(fēng)險(xiǎn)，Z=11.92；于18+w，選擇羊膜腔穿刺，行染色體核型分析、多重?zé)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)（QF-PCR）和單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片（SNP-array）檢測(cè)以明確額外小標(biāo)記染色體（small supernumerary marker chromosome，sSMC）的來源和組成，停經(jīng)23+5周B 超顯示宮內(nèi)胎兒發(fā)育符合孕周，未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常。經(jīng)遺傳咨詢，家屬選擇終止妊娠，拒絕病理解剖。終止妊娠后夫妻雙方進(jìn)行外周血染色體檢查。首次妊娠7w 因子宮右側(cè)角妊娠、稽留流產(chǎn)行清宮術(shù)。非近親婚配，雙方無不良遺傳病家族史，孕婦子宮發(fā)育異常，為不全縱膈子宮。標(biāo)本采集及各項(xiàng)檢查均經(jīng)患者及家屬知情同意并簽署知情同意書、倫理學(xué)委員會(huì)審查通過。

1.2 方法

1.2.1羊膜腔穿刺術(shù) 采用超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺技術(shù)，抽取30 mL 羊水。其中20 mL 用于細(xì)胞培養(yǎng)行染色體核型分析，10 mL 用于提取DNA 行QFPCR 分析和SNP array 檢測(cè)。

1.2.2G 顯帶染色體核型分析 用常規(guī)方法行羊水和外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)、收獲、固定、核型制備和G 顯帶。染色體的命名依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ISCN 2020）》。

1.2.3多重QF-PCR 檢測(cè)各常見染色體STR 等位基因拷貝數(shù) 應(yīng)用多重QF-PCR 對(duì)13、18、21 及X/Y 染色體上的常見STR 位點(diǎn)進(jìn)行基因拷貝數(shù)分析。

1.2.4SNP-array 檢測(cè) SNP-array 采用美國Affymetrix CytoSan 750K array 芯片，通過ChASS 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 G 顯帶核型分析結(jié)果

胎兒羊水細(xì)胞核型分析結(jié)果為47，XN，+mar1［86］/48，XN，+mar1，+mar2［14］，即100 個(gè)細(xì)胞中86 個(gè)含有未知來源的mar1（見圖1），14 個(gè)含有未知來源的mar1 和mar2（見圖2）。其中，mar1 是帶著絲粒的短臂部分，mar2 結(jié)構(gòu)不清。胎兒父母外周血染色體核型未見異常。

圖1 核型：47，XN，+mar1

圖2 核型：48，XN，+mar1，+mar2

2.2 QF-PCR 的檢測(cè)結(jié)果

多重QF-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，21 號(hào)染色體有5 個(gè)STR 位點(diǎn)的結(jié)果異常（見表1），提示染色體近端21q21.1q22.11 區(qū)域?yàn)榍逗先w，21q22.2q22.3 區(qū)域?yàn)槿w型。

表1 21 號(hào)STR 位點(diǎn)與染色體位點(diǎn)的關(guān)系

2.3 SNP array 的檢測(cè)結(jié)果

胎兒羊水 SNP array 的檢測(cè)結(jié)果為 arr［GRCh37］21q11.2q22.2（15016487_40158518）×2-3，21q22.2q22.3（40174787_48093361）× 3，即：21q11.2q22.2 區(qū)存在25.1 Mb 的正常細(xì)胞和三體細(xì)胞的嵌合，嵌合比例約35%；21q22.2q22.3 存在7.9 Mb 的三體。

2.4 胎兒的各種產(chǎn)前篩查及檢測(cè)結(jié)果

表2 匯總胎兒的各種產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

sSMC 是指結(jié)構(gòu)異常、但僅用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)的染色體顯帶不能確定其來源和特征的染色體，其大小通?！芡恢衅谌旧w核型中的20 號(hào)染色體［3］。sSMC 是較罕見的細(xì)胞遺傳現(xiàn)象，在產(chǎn)前診斷中發(fā)生率約0.072%-0.98‰［4，5］。sSMC 主要有3 種形態(tài)：環(huán)狀、雙著絲粒和帶著絲粒的染色體小片段。其中雙著絲粒sSMC 最常見，約占63%；其次是帶著絲粒的染色體小片段，約占26%；環(huán)狀最少見，僅占11%［6］。sSMC 攜帶者具有很強(qiáng)的臨床表型異質(zhì)性，患者可能沒有任何癥狀，也可能表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力障礙、多發(fā)性畸形等嚴(yán)重癥狀據(jù)報(bào)道，其表型效應(yīng)與其來源及基因劑量有關(guān)［7-9］。因此，確定新發(fā)sSMC 的來源及基因劑量是產(chǎn)前診斷的重要內(nèi)容。本文中胎兒核型為47，XN，+mar1［86］/48，XN，+mar1，+mar2［14］，其雙親的核型正常，故該患兒為新發(fā)變異。因此，必需借助其它檢測(cè)手段以明確其來源及基因劑量。

NIPT 的基本原理是利用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)分析胎兒游離DNA 片段（cff DNA）在母親血漿游離DNA 中比例，判斷胎兒是否有非整倍體異常；而cff DNA 主要源自胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞［10，11］。自2011 年進(jìn)入臨床應(yīng)用以來，NIPT 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于胎兒常見染色體非整倍體的產(chǎn)前篩查，表現(xiàn)出良好的檢測(cè)效能，但存在陰性和假陽性，需進(jìn)一步侵入性產(chǎn)前診斷［12-14］。而侵入性產(chǎn)前診斷中最常用的是羊水染色體核型分析。中孕期的羊水細(xì)胞的來源多樣，來源于內(nèi)細(xì)胞群的上胚層細(xì)胞占羊水培養(yǎng)細(xì)胞的大多數(shù)，這些細(xì)胞相對(duì)真實(shí)的反映胎兒的遺傳物質(zhì)，可以識(shí)別染色體結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)（copy number variation，CNV）的異常，一直是產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［15］。但該技術(shù)無法識(shí)別小于10 Mb 的CNVs，而且存在培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)可能失敗、可能引起流產(chǎn)及各種并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)［16］。另一方面，羊水染色體核型分析所用的羊水細(xì)胞需要經(jīng)過體外貼壁培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中，羊水中具有活力的細(xì)胞會(huì)貼壁生長，細(xì)胞克隆的數(shù)量及大小長到一定程度，傳代使細(xì)胞數(shù)量倍增，從接種到收獲約10 天，可能會(huì)出現(xiàn)選擇性的生長偏倚，正常細(xì)胞或異常細(xì)胞都有可能選擇性生長［17］。SNP array 技術(shù)是一種較新的染色體芯片技術(shù)（chromosomal microarray，CMA），不僅能檢出CNVs、大多數(shù)的UPD 和低比例的嵌合體，而且適用于多種來源的標(biāo)本，但無法識(shí)別染色體的平衡易位、倒位等結(jié)構(gòu)異常［18-20］。而另一常用的技術(shù)，QF-PCR，則是利用短串聯(lián)重復(fù)序列（STR，或微衛(wèi)星DNA）的分布廣泛、信息量大和具有高度遺傳的特點(diǎn)，對(duì)染色體上的高度多態(tài)STR 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，間接地判斷STR 所在區(qū)域是否存在CNVs，該技術(shù)具有簡單、準(zhǔn)確、快速和高通量的特點(diǎn)，但也無法識(shí)別染色體的結(jié)構(gòu)異常［21-22］。QF-PCR 和SNP-array 技術(shù)中所用的全基因組的DNA 直接從羊水細(xì)胞中提取，無需細(xì)胞培養(yǎng)，可以較真實(shí)的反映羊水標(biāo)本中遺傳物質(zhì)的相對(duì)量。

本病例NIPT 提示21 三體高風(fēng)險(xiǎn)，Z 值極高，說明胎盤很有可能存在大量的21 三體細(xì)胞，但并不代表胎兒是21 三體。細(xì)胞水平的核型分析發(fā)現(xiàn)了未知來源的mar1 和mar2，未發(fā)現(xiàn)21 三體細(xì)胞。而分子水平的兩種檢測(cè)方法，QF-PCR 和SNP-array，均提示21 號(hào)染色體的近端為嵌合重復(fù)，遠(yuǎn)端為重復(fù)。核型為嵌合體，mar1 是帶著絲粒的短臂部分，mar2 結(jié)構(gòu)不清。綜合檢測(cè)結(jié)果，可以得出發(fā)現(xiàn)：①Q(mào)F-PCR與SNP-array 的結(jié)果基本一致。②細(xì)胞水平與分子水平的檢測(cè)結(jié)果存在部分差異：前者提示21 號(hào)染色體近端存在三體，而后者提示為21 號(hào)染色體的遠(yuǎn)端存在三體。染色體熒光原位雜交（FISH）有助于明確mar1 和mar2 的結(jié)構(gòu)和真實(shí)來源。

核型分析與分子水平的檢測(cè)結(jié)果存在差異，可能存在如下原因：①羊水染色體檢查需要進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，歷時(shí)10-12 天，可能存在異常細(xì)胞的選擇性生長或選擇性不長、mar 的丟失等，導(dǎo)致核型結(jié)果與體內(nèi)真實(shí)情況存在差異；②mar1 有隨體柄的結(jié)構(gòu)，不排除它是21 號(hào)染色體的短臂；③mar2 來源不清，有可能為21 號(hào)末端的多次重復(fù)，導(dǎo)致SNP-array 計(jì)算出來是片段三體（需要FISH 驗(yàn)證）；④mar2 的真實(shí)比例很高：mar2 無著絲粒，體外培養(yǎng)可能導(dǎo)致mar2的丟失（需要FISH 驗(yàn)證）；⑤21 號(hào)末端（21q22.2q22.3）異位或插入到其他染色體而未被發(fā)現(xiàn)；其來源有兩種可能：父母染色體末端的相互異位、新發(fā)突變（需要行高分辨染色體檢測(cè)或FISH 檢測(cè)）。

本文病例顯示，產(chǎn)前的核型分析與分子水平的QF-PCR 和SNP-array 檢測(cè)結(jié)果存在部分差異，故對(duì)于產(chǎn)前診斷的標(biāo)本，建議同時(shí)選用兩種以上的方法進(jìn)行檢測(cè)，特別是懷疑為嵌合體的病例以及存在結(jié)構(gòu)異常的病例。對(duì)于嵌合體的比例的檢測(cè)，F(xiàn)ISH 是金標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于sSMC 的來源、比例及斷裂位點(diǎn)的確定，也需要FISH 進(jìn)行驗(yàn)證，本病例應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用FISH 驗(yàn)證標(biāo)記sSMC 的來源及結(jié)構(gòu)。