王維強，陳廣鴻，葉曉瑩，黃華聰，杜秀婷，黃玉筠，高卓維，，，4*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院，廣東 佛山528300；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)實驗室 國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院，廣東 佛山528308；4.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州510630）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是在大腦最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的40%［1］。盡管包括手術(shù)、放療和化療在內(nèi)的治療策略取得了重大進展，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的5 年整體存活率仍然很低［2］。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤局部異常增殖和侵襲是患者死亡的主要原因，目前臨床上只有替莫唑胺和卡莫司汀兩種藥物用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，然而這兩種藥物均伴有極大的副作用以及容易產(chǎn)生耐藥性，因此尋找新的治療藥物是亟需解決的［3］。本研究擬通過U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，并給予抗癌解毒開竅方含藥血清進行干預(yù)，觀察抗癌解毒開竅方治療膠質(zhì)瘤作用并進一步探討抗癌解毒開竅方抑制膠質(zhì)瘤的作用機理。

1 材料和方法

1.1 動物和細(xì)胞

SD 大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，實驗單位使用許可證號SYXK（粵）20200056，動物實驗通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會倫理審查（20210731001），U87 細(xì)胞購買自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購買自美國Gibco 公司。CCK-8 購買自北京同仁。結(jié)晶紫染色液購買自凱基生物科技有限公司。PI3K（ab32089）、p-PI3K（ab278545）、Akt（ab18785）、p-Akt（ab81283）、GAPDH（ab8245）抗體購自美國Abcam 生物科技有限公司。

1.3 中藥配制及含藥血清制備

中藥購買自致信藥業(yè)，抗癌解毒開竅方由常規(guī)人的用量為：藤梨根90 g、山慈菇15 g、半枝蓮15 g、龍葵15 g、腫節(jié)風(fēng)20 g、壁虎10 g、土鱉蟲5 g、桃仁10 g、石菖蒲5 g。抗癌解毒開竅方低、中、高濃度組分別為0.5、1、2 倍常規(guī)人用量，常規(guī)煎煮中藥備用。取健康SD 雄性大鼠80 只，SPF 級，體重（220±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分為4 組（對照組20 只、抗癌解毒開竅方低、中、高濃度組各20 只），按人與大鼠體表面積比換算給藥等效劑量［4］，對照組和抗癌解毒開竅方分別給予生理鹽水或煎煮好的抗癌解毒開竅方（9.8 g/kg、19.6 g/kg、39.2 g/kg），以1.5 mL/100 g 的比例灌胃，每12 h 一次，每日2 次，共7 d，第8 天于大鼠灌胃后2 h 內(nèi)，無菌條件下行腹主動脈采血，離心取血清，56 ℃下30 min 滅活補體，經(jīng)無菌細(xì)胞過濾器除去細(xì)菌后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CCK-8 檢測細(xì)胞活力

收集對數(shù)生長期的U87 細(xì)胞（5×103個/孔）接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，分別加入5%抗癌解毒開竅方低、中、高濃度組含藥血清以及對照血清處理24 h。每個孔加入10 μL CCK-8 溶液，并在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h。使用微孔板讀取器測量450 nm 波長的A值計算各組細(xì)胞活力。

1.5 EdU 染色檢測細(xì)胞增殖能力

消化、離心收集U87 細(xì)胞、調(diào)整細(xì)胞密度至5×103個接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁長至約80%后，加入5%抗癌解毒開竅方低、中、高濃度組含藥血清以及對照血清，并在培養(yǎng)基中加入10 μm EdU溶液處理24 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后根據(jù)試劑盒說明書依次進行Apollo567 和Hochest33342染色。熒光顯微鏡下分別對3 個隨機視野下的藍(lán)色細(xì)胞（Hochest33342，總細(xì)胞）及紅色細(xì)胞（EdU，EdU陽性細(xì)胞）計數(shù)，EdU 陽性百分比=EdU 陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 Transwell 細(xì)胞遷移實驗

使用Transwell 細(xì)胞遷移實驗評估細(xì)胞遷移能力。實驗前，U87 細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱中饑餓24 h。隨后消化收集細(xì)胞，并重懸于的無血清DMEM 培養(yǎng)基中。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105并接種于上室，加入抗癌解毒開竅方含藥血清，同時24 孔板下室加入500 μL 含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h 后，遷移細(xì)胞在室溫下用4%的多聚甲醛固定10 min，接著用結(jié)晶紫染色20 min。用光學(xué)顯微鏡在5 個隨機選擇的視野中計算染色細(xì)胞。

1.7 蛋白印跡分析（Western blot）

U87 細(xì)胞用不同濃度抗癌解毒開竅方含藥血清處理24 h。使用RIPA 緩沖液從細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。使用BCA 蛋白定量試劑盒對總蛋白質(zhì)進行定量。取20 μg 細(xì)胞總蛋白質(zhì)通過10%SDS-PAGE 分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。隨后，在室溫下，使用5%的脫脂牛奶將膜封閉1 h。然后膜與相應(yīng)的一抗進行孵育，主要包括以下抗體：PI3K（1 ∶1 000）、p-PI3K（1 ∶1 000）、AKT（1 ∶1 000）、p-AKT（1 ∶1 000）以及GAPDH（1 ∶3 000）。經(jīng)過一夜的孵育后，膜與二抗在室溫下繼續(xù)孵育1 h。蛋白條帶通過ECL 化學(xué)發(fā)光發(fā)進行可視化。蛋白表達是使用image J 軟件與GAPDH 作為內(nèi)源性參照進行量化。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 抗癌解毒開竅方對U87 細(xì)胞活力和增殖的影響

為了研究抗癌解毒開竅方的潛在抗腫瘤作用，采用CCK-8 評估了不同濃度的抗癌解毒開竅方含藥血清處理24 h 對U87 細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，在干預(yù)24 h 后，抗癌解毒開竅方含藥血清顯著抑制了U87 細(xì)胞的活性，并呈濃度依賴性。接著我們采用EdU 染色法檢測不同濃度抗癌解毒開竅方對U87 細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果如圖1B-C 所示，與對照組相比，抗癌解毒開竅方低、中、高濃度組均能抑制U87 細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05）。EdU 染色結(jié)果與CCK-8 結(jié)果一致，提示抗癌解毒開竅方含藥血清能夠抑制U87 細(xì)胞的活力與增殖。

圖1 抗癌解毒開竅方抑制U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力與增殖

2.2 抗癌解毒開竅方對U87 細(xì)胞遷移的影響

我們采用Transwell 細(xì)胞遷移實驗觀察抗癌解毒開竅方含藥血清對U87 細(xì)胞遷移的影響。分別用不同濃度抗癌解毒開竅方處理細(xì)胞16 h 后對遷移細(xì)胞進行染色。結(jié)果如圖2 所示，與對照組細(xì)胞（553.9±42.7 個/視野）相比，在抗癌解毒開竅方含藥血清治療后，U87 細(xì)胞的遷移能力顯著下降（P＜0.05），抗癌解毒開竅方低、中、高濃度組每視野的遷移細(xì)胞數(shù)分別為458.5±39.0、328.0±35.5、168.1±21.4 個。Transwell 細(xì)胞遷移實驗結(jié)果表明，抗癌解毒開竅方含藥血清抑制了U87 細(xì)胞的遷移能力。

圖2 抗癌解毒開竅方抑制U87 細(xì)胞遷移

2.3 抗癌解毒開竅方對U87 細(xì)胞PI3K/Akt 信號通路的影響

PI3K/Akt 信號通路在腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。為了研究抗癌解毒開竅方含藥血清對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PI3K/Akt 信號通路的影響，我們采用western blot 檢測抗癌解毒開竅方含藥血清處理后U87 細(xì)胞蛋白表達水平。結(jié)果如圖3 所示，經(jīng)過抗癌解毒開竅方含藥血清處理后，與對照組細(xì)胞相比，U87 細(xì)胞中的p-PI3K 和p-Akt 的表達顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果表明，抗癌解毒開竅方含藥血清處理降低了U87 細(xì)胞中PI3K/Akt 信號通路的蛋白表達。

圖3 抗癌解毒開竅方抑制U87 細(xì)胞PI3K/Akt 信號通路激活

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最具有攻擊性的原發(fā)性腦腫瘤，中位存活率約為14.6 個月［5］。侵入性是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要特征，在發(fā)現(xiàn)時惡性細(xì)胞多已擴散到正常的腦組織，導(dǎo)致極少患者能夠行使神經(jīng)外科手術(shù)作做為根治性治療。腫瘤異質(zhì)性是傳統(tǒng)化療和靶向治療失敗的另一個重要因素［6］。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不佳，且大多患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)性腫瘤并產(chǎn)生抗藥性。因此需要新的治療方法來針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在抵抗機制。

中醫(yī)學(xué)并無“膠質(zhì)瘤”之病名，根據(jù)其病灶部位，可將其歸為“頭風(fēng)”、“頭痛”、“癲癇”、“偏枯”等。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對膠質(zhì)瘤的認(rèn)識，僅限于該疾病引起的各種癥狀，如頭痛、眩暈、嘔吐等，因此現(xiàn)代各大醫(yī)家對該疾病的病因病機的論述各有見解。通過綜合分析針對膠質(zhì)瘤的11 篇臨床報道［7-8］，我們認(rèn)為癌毒結(jié)聚是其主要病機。我們前期研究也指出：正氣虧虛基礎(chǔ)上，痰凝、血瘀參與腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)，是導(dǎo)致癌毒結(jié)聚的關(guān)鍵因素［9］。而對于腦膠質(zhì)瘤而言，臨床上更多時候表現(xiàn)為邪去則正安。我們根據(jù)上述理論和臨床實踐，總結(jié)出抗癌解毒開竅方。抗癌解毒開竅方由藤梨根、山慈菇、半枝蓮、龍葵、腫節(jié)風(fēng)、壁虎、土鱉蟲、桃仁、石菖蒲組成。該復(fù)方的合理組合，分別從抗癌和開竅兩個方面治療腦膠質(zhì)瘤，較好契合膠質(zhì)瘤以“癌毒結(jié)聚”為主的病因病機，同時能夠“引藥入腦”。研究發(fā)現(xiàn)抗癌解毒開竅方的君藥藤梨根具有良好的抗腫瘤作用［10］，我們的既往研究發(fā)現(xiàn)藤梨根中的兩個主要活性成分熊果酸和齊墩果酸通過促腫瘤細(xì)胞凋亡、鐵死亡以及抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗腫瘤作用［11］。半枝蓮與山慈菇、龍葵與腫節(jié)風(fēng)、桃仁與土鱉蟲是林麗珠教授治療惡性腫瘤的經(jīng)驗常用藥對［12］?，F(xiàn)代藥理研究表明半枝蓮?fù)ㄟ^下調(diào)端粒酶活性抑制U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡［13］。開竅藥石菖蒲現(xiàn)代藥理研究表明能降低缺血再灌注小鼠腦梗塞的大小，改善了腦水腫，降低了血腦屏障滲透性，恢復(fù)了神經(jīng)功能［14］。本研究對抗癌解毒開竅方抑制膠質(zhì)瘤作用進行研究。CCK-8 結(jié)果顯示抗癌解毒開竅方劑量依賴性地抑制U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性。進一步EdU 染色結(jié)果提示抗癌解毒開竅方能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖。Transwell 遷移實驗結(jié)果則提示，抗癌解毒開竅方顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。以上結(jié)果提示抗癌解毒開竅方能夠有效地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。

據(jù)報道，PI3K/Akt 信號通路是大多數(shù)人類癌癥中最常激活的途徑之一［15］。Akt 被認(rèn)為是PI3K/Akt 信號通路的中心蛋白，調(diào)節(jié)100 多個下游基質(zhì)的活動。Akt 是一種血清/三氨酸蛋白激酶，磷酸激活后在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用。Akt活化被認(rèn)為是許多人類癌癥的標(biāo)志，它通過促進細(xì)胞增殖與遷移，抑制細(xì)胞凋亡，并增加腫瘤突變率促進癌癥的發(fā)展［16］。研究發(fā)現(xiàn)替莫唑胺通過激活PI3K/Akt 信號通路從而活化膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt/βcatenin 信號通路，這可能導(dǎo)致替莫唑胺療效下降以及耐藥性的出現(xiàn)［17］。抑制Akt 能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與遷移，促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［18］。因此，針對Akt 信號通路是尋找腫瘤治療新藥物的一個重要方向。本研究發(fā)現(xiàn)，抗癌解毒開竅方能顯著抑制U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平，提示抗癌解毒開竅方抑制U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與遷移的作用可能是通過抑制PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮的。研究發(fā)現(xiàn)抗癌解毒開竅方中多種有效成分具有抑制PI3K/Akt 信號通路的作用。半枝蓮總黃酮抑制PI3K/Akt/mTOR 通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬及凋亡，抑制裸鼠皮下一移植瘤的生長［19］。甘草查爾酮A 抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生自噬，這些作用可能與其抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路有關(guān)［20］。這些有效成分可能是抗癌解毒開竅方抑制PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥復(fù)方治療腫瘤往往是通過多通路多靶點發(fā)揮作用，我們在后續(xù)的研究將更深入研究抗癌解毒開竅方的潛在作用機制。

綜上所述，本研究表明抗癌解毒開竅方能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與遷移，其作用機制可能是通過抑制PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮的。