金可，黃建安,2,3，熊立瑰,2,3，劉碩謙,2,3，覃小洪，彭靖，李銀花,2,3*，李娟,2,3*

黃化變異茶樹石門黃葉理化分析及茶氨酸相關(guān)基因表達研究

金可1，黃建安1,2,3，熊立瑰1,2,3，劉碩謙1,2,3，覃小洪4，彭靖1，李銀花1,2,3*，李娟1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128； 4. 湖南石門渫峰名茶有限公司，湖南 石門 415300

黃化變異是茶樹較為常見的葉色變異現(xiàn)象，黃化茶樹的特征性化學(xué)成分含量會發(fā)生較大變化，其中氨基酸含量顯著增加，研究此現(xiàn)象形成的原因有助于揭示葉色與氨基酸代謝的相關(guān)性。本研究以石門地區(qū)自然黃化變異茶樹為材料，對其全黃、全綠和黃綠葉片進行葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析和主要生化成分檢測，采用實時熒光定量PCR方法檢測茶氨酸生物合成相關(guān)基因（，，）在不同葉色間的表達水平并分析它們與茶氨酸含量的相關(guān)性。結(jié)果表明：（1）與綠葉相比，黃化葉的葉綠體結(jié)構(gòu)存在異常，主要表現(xiàn)為類囊體膜結(jié)構(gòu)不清晰；（2）生物堿含量由高到低分別為黃葉、綠葉、黃綠葉，組間差異顯著；（3）沒食子酸、總兒茶素含量在綠葉中最高，在其他兩組間無顯著差異，多種兒茶素組分含量隨葉片轉(zhuǎn)綠而提高，但EC與葉片黃化程度呈正相關(guān)；（4）氨基酸和茶氨酸含量變化趨勢與葉片黃化趨勢相同；（5）基因和基因在綠葉中表達量最高，在黃綠色葉片中表達量最低，基因在全黃葉片中表達量最高；（6）茶氨酸含量與、、基因表達量均無顯著相關(guān)性?？梢?，黃化茶樹葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)異常，其物質(zhì)代謝會受到影響，氨基酸分解被抑制，并富集在黃化葉中。

黃化茶樹；茶氨酸；茶氨酸合成酶；谷氨酰胺合成酶

植物葉片顏色由其所含色素的共同作用決定[3]，在黃化葉中，與葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關(guān)的基因表達量下降[9-10]，而參與類胡蘿卜素合成的基因表達量升高[11]，使葉綠素與類胡蘿卜素的比值降低，葉片呈黃色。強光刺激黃化茶樹調(diào)控多種基因的表達，調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的含量，如下調(diào)多酚類物質(zhì)合成基因表達，使多酚類含量下降[12]。茶氨酸是茶樹體內(nèi)特有的游離氨基酸，在黃化葉中含量較高。茶氨酸的合成需要茶氨酸合成酶（TS）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺酶（GLS）等多種酶的共同作用[13-14]，其中，GS是氮同化的限速酶[15]，編碼基因序列與有高度同源性[16]。雖然目前關(guān)于白化、黃化茶樹中高氨基酸含量與、表達量之間聯(lián)系的研究較多[8,10,17-18]，但所得結(jié)論不同，也未探明氨基酸富集的機理。

黃化變異茶樹的研究是茶樹資源研究的熱點，本研究材料為湖南省石門縣雁池鄉(xiāng)茶園中發(fā)現(xiàn)的1株發(fā)生穩(wěn)定黃化變異的茶樹，樹齡20年，為本地中小葉群體種，其葉片根據(jù)光照強度由強到弱而呈現(xiàn)由黃到綠的葉色。經(jīng)過連續(xù)4年的觀察，發(fā)現(xiàn)此茶樹變異現(xiàn)象穩(wěn)定，長勢較好，為方便后續(xù)研究工作，暫時將此茶樹命名為石門黃葉。本研究對石門黃葉3種不同顏色葉片（綠、黃綠、黃）進行葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析、主要生化成分檢測、茶氨酸合成相關(guān)基因（、、）相對表達量分析，旨在研究茶樹黃化變異現(xiàn)象形成的原因以及同株茶樹中不同葉片（黃化葉與綠葉）的茶氨酸積累量與葉色變異的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的材料采自石門縣雁池鄉(xiāng)20年生茶園中1株黃化變異茶樹（石門黃葉，本地中小葉群體種）。從不同生長部位剪取枝條插入水中保存帶回實驗室，取一芽二葉按顏色分為A、B、C 3組，鮮葉分組情況如圖1所示。鮮葉從枝條上摘下后用液氮迅速冷凍并存于–80℃冰箱中備用。

1.2 葉綠體超微結(jié)構(gòu)測定

葉綠體超微結(jié)構(gòu)的測定參照Li等[19]的檢測方法。

1.3 生化成分檢測

茶葉中茶多酚、兒茶素組分的檢測均參照GB/T 8313—2018；氨基酸總量的檢測參照GB/T 8314—2013；茶氨酸的檢測參照龔雨順等[20]的方法。

1.4 熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

采用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取茶樹葉片樣品總RNA。用NanoDrop 2000/2000c檢測所提取RNA樣品的濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總RNA的完整性。采用PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara）完成對所提取RNA的反轉(zhuǎn)錄，得到模板cDNA。

在GenBank（GB）數(shù)據(jù)庫中搜索得到3段基因序列：（JN226569）、（JQ925872）和（JQ925873）。以18?s RNA為內(nèi)參基因，使用在線引物設(shè)計軟件（Primer3Plus）設(shè)計引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR采用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（Takara）試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)

由圖2可知，石門黃葉不同葉片中的葉綠體超微結(jié)構(gòu)存在較大差異。綠葉中，葉綠體緊貼細胞壁，呈橢圓形，體積相近，結(jié)構(gòu)完整，類囊體膜系統(tǒng)清晰有序，淀粉粒數(shù)量較多且清晰可見（圖2-A）。黃化葉細胞中，中央液泡明顯萎縮，含有較多解體組織；葉綠體體積差別較大，少量離壁；片層結(jié)構(gòu)模糊，基粒類囊體數(shù)量較少，基質(zhì)類囊體數(shù)量較多；未見明顯淀粉粒；基質(zhì)中存在較多的囊狀小泡及較大的嗜鋨顆粒（圖2-B，圖2-C）。

2.2 生物堿含量

由表2可知，可可堿、茶堿和咖啡堿在不同葉片中的變化趨勢相同，均在黃葉中含量最高，其次為綠葉、黃綠葉，組間均存在顯著性差異。在主要的生物堿成分中，咖啡堿含量明顯高于其他成分。生物堿總量在黃葉中最高，達(4.606±0.023)%。

2.3 沒食子酸及兒茶素組分含量

不同葉片兒茶素各組分的含量變化如圖3所示，表沒食子兒茶素（EGC）含量的變化趨勢為黃綠葉＞綠葉＞黃葉（<0.05）；D、L型兒茶素（,-C）的含量在黃葉中最高，在其他兩組間無顯著差異；表兒茶素（EC）在黃葉中含量最高，在綠葉中含量最低(<0.05)；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的變化趨勢為綠葉＞黃綠葉＞黃葉（<0.05），與葉片黃化趨勢相反；沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）在綠葉中含量最高，其次為黃葉、黃綠葉(<0.05)；表兒茶素沒食子酸酯（ECG）在黃綠葉中的含量顯著低于黃葉和綠葉（<0.05），而在黃、綠葉兩組間無顯著差異。由表3可知，沒食子酸和總兒茶素含量的變化趨勢相同，均在綠葉中最高，在黃葉和黃綠葉中無顯著差異。

注：A-1和A-2：綠色葉片；B-1和B-2：黃綠色葉片；C-1和C-2：黃色葉片；Ch：葉綠體；CW：細胞壁；GT：基粒類囊體；Gr：基粒；OG：嗜鋨顆粒；SG：淀粉粒；ST：基質(zhì)類囊體；Va：液泡；Ve：囊狀小泡

2.4 氨基酸總量與茶氨酸含量

表3顯示，茶氨酸含量的變化趨勢為黃葉＞黃綠葉＞綠葉（＜0.05），與葉片黃化程度呈正相關(guān)，最高達到(2.597±0.008)%。氨基酸總量在黃葉中含量最高，為(5.479±0.039)%，在黃綠葉和綠葉間無顯著差異。

2.5 基因相對表達量及其與茶氨酸含量的關(guān)系

以全綠葉片作為對照組（圖4），和基因在綠葉中表達量最高，其次為黃葉、黃綠葉，各組間均存在顯著差異；基因在黃葉中表達量最高，在黃綠葉中表達量最低（＜0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示，葉片中、、相對表達量與茶氨酸含量的相關(guān)系數(shù)分別為–0.408、–0.462和0.190，均無顯著相關(guān)性（＞0.05）。

3 討論

植物生長發(fā)育所需的物質(zhì)基礎(chǔ)來自于在葉綠體中進行的光合作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃化葉片中葉綠體的類囊體膜系統(tǒng)異常[9-10,21]。類囊體根據(jù)形態(tài)不同分為基粒類囊體和基質(zhì)類囊體，基粒類囊體是光系統(tǒng)Ⅱ和捕光天線復(fù)合體Ⅱ的主要分布區(qū)[22]。葉綠體中嗜鋨顆粒的存在代表了類囊體膜結(jié)構(gòu)和光合色素的降解[23]。本研究觀察對比了黃化葉片與綠色葉片的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)黃化葉中，葉綠體的類囊體膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模糊，基粒類囊體較少，淀粉粒體積較小，中央液泡中含有較多解體組織，出現(xiàn)較大的嗜鋨顆粒和多個囊狀小泡，與Li等[19]、張晨禹等[23]的結(jié)果一致。表明黃化葉在受到強光脅迫時，葉綠體功能失常，葉綠素的合成效率下降，而類胡蘿卜素的合成增加[16]，使葉片褪綠顯黃。

表2 不同葉片中生物堿及其主要組分的含量

注：A：綠色葉片；B：黃綠色葉片；C：黃色葉片；不同小寫字母表示組間差異達到顯著水平（<0.05）。下同

Note: A: green leaves. B: yellow-green leaves. C: yellow leaves. Different lower case letters mean significant difference between groups (<0.05). The same below

表3 不同葉片中主要品質(zhì)成分的含量

注：不同小寫字母表示組間差異達到顯著水平（P<0.05），下同

圖4 TS、CsGS1、CsGS2基因的相對表達量

多項研究表明，類黃酮合成基因在黃化葉片中表達量下降[11,24]，與本研究結(jié)果相符，說明強光會刺激黃化葉下調(diào)多酚類物質(zhì)合成基因的表達，使葉片中多酚類物質(zhì)含量降低。而本研究中EC含量在黃葉中最高，可能是因為其還原能力強，可還原葉片在強光脅迫下產(chǎn)生的過氧化物質(zhì)，促進EC合成能夠起到保護葉片的作用[25-26]。生物堿和氨基酸是茶樹鮮葉中主要的含氮化合物[27]。研究發(fā)現(xiàn)，與綠葉相比，黃化葉中的蛋白水解酶活性較強[28]，可溶性蛋白含量降低，茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量較高[8]。由此推測，在本研究的黃化葉中，蛋白質(zhì)的降解是氨基酸和茶氨酸含量升高的原因之一。作為氮代謝次生產(chǎn)物，生物堿含量在黃化葉片中含量較高，可能是多種蛋白質(zhì)被降解為游離氨基酸，生物堿的嘌呤環(huán)供體增加，促進了生物堿的合成。

許多研究人員分析了、表達水平與葉色變異茶葉中茶氨酸含量的關(guān)系，得出了不同的結(jié)果[10,17-18]，而本研究發(fā)現(xiàn)、、基因的表達量與茶氨酸含量均無顯著相關(guān)性，與Cheng等[8]的研究結(jié)果相似。因此推測，黃化葉片中茶氨酸含量高的原因，不是因為其合成相關(guān)基因表達上調(diào)所致，而是由于茶氨酸分解路徑受阻。

本研究推測氨基酸在黃化葉中富集的機理是：茶樹葉片在一定光照條件下，下調(diào)葉綠體發(fā)育、葉綠素合成相關(guān)基因的表達，使葉片呈黃色，從而抑制光合作用，影響茶樹物質(zhì)代謝，同時調(diào)控與氮代謝相關(guān)基因，促進蛋白質(zhì)分解，抑制茶氨酸等氨基酸的分解，積累氨基酸。但是目前對茶樹中茶氨酸分解路徑的研究較少，因此不能明確黃化茶樹中茶氨酸分解能力變?nèi)醯臋C制，而且茶樹體內(nèi)的茶氨酸代謝路徑極為復(fù)雜，易受茶樹的品種、栽培環(huán)境及氮源等多種因素的影響，明確黃化變異茶樹的黃化機理較困難。而石門黃葉可為茶樹黃化機理研究排除遺傳背景、環(huán)境條件等部分因素的影響，是較優(yōu)的茶樹葉色變異研究材料。黃化茶樹因葉片在一年中長時間呈黃色，光合能力弱，在移栽或扦插前期成活率較低[29]，長勢較普通茶樹品種差[7]。而石門黃葉的黃化變異較為穩(wěn)定，酚氨比低，可在光強較弱的季節(jié)返綠，且長勢較好，具有選育成為新品種的潛力。

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Research of Theanine-related Genes Expressed in Etiolated Tea Plant()

JIN Ke1, HUANG Jian'an1,2,3, XIONG Ligui1,2,3, LIU Shuoqian1,2,3, QIN Xiaohong4, PENG Jing1, LI Yinhua1,2,3*, LI Juan1,2,3*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 4. Xie Feng Famous Tea, Shimen 415300, China

Etiolation is a common morphological variation in tea plants. In those mutants, the contents of the characteristic metabolites change greatly and amino acids are highly accumulated. Studying the reasons of these changes can help to reveal the relationship between leaf color variation and amino acid metabolism. In this study, an etiolated tea plant, which was found accidentally in Shimen area, was used as the research material. As a leaf-color mutant, it has three different colored leaves: yellow, green and yellow-green.The ultrastructure of the chloroplasts, the contents of characteristic metabolites, the expression levels of theanine-related genes (,,) andthe correlation between the expression levels and theanine in different leaveswere studied. The results show: (1) the chloroplast structure of the yellow leaves was abnormal, which mainly presented as the blurry structure of the thylakoid membrane. (2) the alkaloid contents reduced from yellow, green to yellow-green leaves with significant differences. (3) gallic acid and total catechin contents were the highest in green leaves, and there was no significant difference between the other two groups. The contents of multiple catechins increased as the leaves turned green, but the contents of EC were positively related to the etiolation. (4) the contents of amino acids and theanine increased as the leaves turned yellow. (5)andshowed the highest expressions in green leaves but the lowest expressions in yellow-green leaves.Whileexhibited the highest expression in yellow leaves. (6) high theanine content was not related to the expressions of,and. In summary, the chloroplast structure of etiolated tea plant is abnormal, the metabolism is affected, the amino acid decomposition is inhibited in the etiolated leaves, which result in the enrichment of amino acids.

etiolated tea plant, theanine, theanine synthetase, glutamine synthetase

S571.1

A

1000-369X(2021)01-040-08

2020-06-22

2020-08-24

國家自然科學(xué)基金（U19A2030、31500567）、中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項（2019XF5041）

金可，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。*通信作者：liyinhua1012@126.com，xixi_lj@126.com

（責(zé)任編輯：黃晨）