董燕茹，曹妍彥，盧佳純，梅思凡，河潤，陳萍

兒茶素與咖啡堿絡(luò)合物的晶體學(xué)研究

董燕茹，曹妍彥，盧佳純，梅思凡，河潤，陳萍*

浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江 杭州 310058

通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)兒茶素和咖啡堿占綠茶乳酪總質(zhì)量的88%以上。以乳酪中含量最高的兩種酯型兒茶素和對應(yīng)的非酯型兒茶素與咖啡堿絡(luò)合建立綠茶乳酪簡化體系CATs-CAF，發(fā)現(xiàn)4種兒茶素在沉淀中的分布比例為EC∶ECG∶EGC∶EGCG≈1∶2∶1∶2。選用ECG和EC分別與咖啡堿絡(luò)合制備單晶，掃描電鏡觀察絡(luò)合前后晶體的顯微形貌，X-射線單晶衍射分析立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，兩種絡(luò)合物晶體均為針狀，通過分子間氫鍵和面對面π-π堆積作用形成。其中，EC可與相鄰EC、CAF分子形成O-H...O型氫鍵，通過A環(huán)和CAF的六元環(huán)發(fā)生π-π堆積，形成1∶1絡(luò)合物；而ECG可與相鄰ECG、CAF分子形成O-H...O型氫鍵以及O-H...N型氫鍵，并且所有芳香環(huán)均能與CAF發(fā)生π-π堆積，形成2∶4絡(luò)合物，每個ECG的A環(huán)、B環(huán)可分別與相鄰兩個ECG的B環(huán)、A環(huán)共用CAF的六元環(huán)，而ECG的D環(huán)和CAF的六元環(huán)則通過兩種排列方式在a軸上延伸。

茶乳酪；絡(luò)合機(jī)理；掃描電鏡；X-射線單晶衍射

茶湯在冷卻后變渾濁的現(xiàn)象被稱為“冷后渾”，其中的懸浮或沉淀物質(zhì)被稱為“茶乳酪”。1944年，Bradfield等首先提出了茶乳酪與茶湯品質(zhì)之間的關(guān)系，引起了廣泛關(guān)注[1]。目前關(guān)于茶乳酪的研究主要包括沉淀的物質(zhì)組成、沉淀形成的影響因素和少量機(jī)理研究。

茶乳酪由咖啡堿、茶多酚、蛋白質(zhì)、多糖、含氮化合物、類黃酮以及礦物質(zhì)等物質(zhì)組成[2-8]，不同的化學(xué)組分參與沉淀形成的能力和貢獻(xiàn)度有所不同，而咖啡堿和茶多酚對茶乳酪的形成貢獻(xiàn)最大[9]。Roberts[2]首次分析了紅茶乳酪的主要化學(xué)組成為茶黃素、茶紅素和咖啡堿，而Penders等[10-11]的研究也表明咖啡堿和兒茶素及其氧化物對紅茶茶湯的茶乳酪形成具有重要作用。Yin等[4]研究表明，綠茶乳酪中兒茶素類占總質(zhì)量的12.80%~42.50%，主要為表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）。Xu等[5]基于咖啡堿與酯型兒茶素的含量，對茶湯沉淀量進(jìn)行了公式預(yù)測。

茶乳酪的形成受諸多因素影響，包括茶樹品種[12]、原料嫩度[5]、原料發(fā)酵程度[9]、加工[13]與提取工藝[14-15]等。不同茶類的生化基質(zhì)差異較大[16]，沖泡后茶湯沉淀的形成量、化學(xué)組分以及粒徑大小等也有所不同[9]。綠茶乳酪的粒徑明顯比紅茶乳酪大，且兩者的化學(xué)組成完全不同[17]，其形成機(jī)理可能也有所差別。對紅茶乳酪的研究顯示，咖啡堿可通過氫鍵和π-π堆積相互作用與茶黃素形成2∶1絡(luò)合物[18]，蛋白中的氨基酸分子也可通過氫鍵和疏水作用力與多酚類物質(zhì)絡(luò)合[19]。

然而，目前關(guān)于綠茶乳酪形成機(jī)理的研究相對較少，尤其缺乏微觀層面的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)解析。X射線衍射分析技術(shù)是現(xiàn)代物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)無損分析、鑒定和研究的基本手段，也是目前研究原子在三維空間分布的最精確手段。其中X射線單晶衍射技術(shù)對于物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)新理論的構(gòu)建具有獨(dú)特優(yōu)越性，在材料學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[20]，但在茶葉領(lǐng)域中的應(yīng)用鮮有報道，可能會對探明綠茶乳酪形成機(jī)制有所幫助。

因此，本研究通過高效液相色譜結(jié)合掃描電鏡和X射線單晶衍射手段，構(gòu)建綠茶乳酪的簡化體系，對綠茶乳酪中兒茶素類物質(zhì)和咖啡堿的絡(luò)合機(jī)理進(jìn)行深入探究，為綠茶乳酪的形成機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

綠茶（惠明茶），購自浙江六江源綠色食品有限公司。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品：兒茶素（C）、EC、沒食子兒茶素（GC）、EGC、兒茶素沒食子酸酯（CG）、ECG、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、EGCG；生物堿標(biāo)準(zhǔn)品：咖啡堿（CAF）、可可堿（TB）、茶堿（TP）；沒食子酸（GA），均購自上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%）。Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司。本試驗所用到的甲醇、甲酸、乙腈、乙酸均為色譜級，購自德國Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Prominence LC-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司/日本島津公司），Synergy UV水過濾系統(tǒng)（法國默克公司），SIGMA-3K15型離心機(jī)（德國西格瑪公司），Agilent5 TC-C18分離柱（美國安捷倫科技有限公司），HWS28恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），LE104E型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），SU8010高分辨冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司），APEXII型X射線晶體分析儀（德國布魯克AXS有限公司），Synergy H1全功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司），CHRIST凍干機(jī)（德國格馬有限責(zé)任公司）。

1.3 樣品處理

稱取25?g綠茶茶樣于500?mL錐形瓶中，加入300?mL沸水，移入沸水浴中浸提30?min，浸提完畢趁熱減壓過濾，冷卻后以9?600?r·min-1離心25?min，分離上清液定容至300?mL，于4℃冰箱中冷藏誘導(dǎo)沉淀，2?d后離心（9?600?r·min-1，4℃，25?min）分離得到茶乳酪，作為待測樣品。

1.4 綠茶乳酪物質(zhì)組成的測定

總質(zhì)量測定：將綠茶乳酪樣品于–40℃下真空冷凍干燥后稱重。

蛋白質(zhì)質(zhì)量的測定：建立蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[21]，測定綠茶乳酪中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

沒食子酸、兒茶素以及生物堿的測定：采用高效液相色譜（HPLC）檢測法對GA、8種兒茶素、3種生物堿進(jìn)行測定，用12種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外標(biāo)法定量。檢測條件：Agilent TC-C18色譜柱（4.6?mm×250?mm，5?μm）；流動相A為乙腈∶乙酸∶水=6∶1∶193，流動相B為乙腈∶乙酸∶水=60∶1∶139。45?min梯度洗脫，Ｂ相初始濃度20%，35?min上升至65%，而后降至20%；流速1?mL·min-1；檢測波長280?nm；柱溫設(shè)置25℃；進(jìn)樣量10?μL。

1.5 綠茶乳酪簡化體系（CATs-CAF）的建立

將4種兒茶素單體（EC、ECG、EGC、EGCG各0.10?mmol）混合物（CATs）和咖啡堿（0.40?mmol）在100℃下溶于2?mL超純水中，室溫下靜置48?h，分離得到上清液和粘性沉淀物。粘性沉淀物溶解于甲醇溶劑中，使用HPLC檢測法（同1.4章節(jié)）分別測定體系中上清液和沉淀的物質(zhì)組成及含量。

1.6 絡(luò)合物晶體的制備

選用一對酯型和非酯型兒茶素（ECG和EC），分別與CAF以1∶1的摩爾比溶于超純水中，100℃水浴30?min后，室溫下靜置緩慢結(jié)晶，得到ECG-CAF和EC-CAF絡(luò)合物晶體。

1.7 絡(luò)合物晶體的掃描電鏡觀察

取適量制備好的絡(luò)合物晶體以及EC、ECG和CAF單體，分別在25℃下真空干燥12?h。取真空干燥后的樣品，均勻涂抹在雙面碳導(dǎo)電膠帶上，將涂好的樣品放置于HITACHI MC1000離子噴鍍儀進(jìn)行離子噴鍍，噴鍍完成后用掃描電鏡（SU8010）觀察形貌。儀器參數(shù)設(shè)置：加速電壓ETH=3?kV，分辨率1.0?nm/15?kV，工作距離WD=9?mm，冷場發(fā)射型檢測器，探測器Signal A=SE2，分析級SDD探頭分辨率Mn K=129?eV。

1.8 絡(luò)合物晶體的結(jié)構(gòu)測定

選取大小合適的絡(luò)合物晶體，在Bruker APEX-II CCD衍射儀上進(jìn)行衍射實(shí)驗：EC-CAF用Ga K射線（=1.341?39?nm），掃描方式，在2.98°≤≤55.00°的范圍內(nèi)收集獨(dú)立衍射點(diǎn)；ECG-CAF用Cu K射線（=1.541?78?nm），掃描方式，在3.50°≤≤72.20°的范圍內(nèi)收集獨(dú)立衍射點(diǎn)。EC-CAF采用的權(quán)重方案分別為=[2(o2)+(0.083?9)2]-1和=(o2+2c2)/3，ECG-CAF采用的權(quán)重方案分別為=[2(o2)+(0.137?3)2+1.558?2]-1和=(o2+2c2)/3。絡(luò)合物的晶體學(xué)參數(shù)列于表1。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)以平均值表示，3次重復(fù)，統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 8軟件處理，采用多重檢驗進(jìn)行分析，<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。利用Mercury和Diamond軟件分析晶體結(jié)構(gòu)和作用力。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠茶乳酪的物質(zhì)組成

本研究中，25.0?g綠茶茶樣沖泡的茶湯通過低溫誘導(dǎo)沉淀后得到綠茶乳酪總質(zhì)量為0.284?0?g。用Bradford比色法測得綠茶乳酪中蛋白質(zhì)的質(zhì)量為0.031?7?g，占綠茶乳酪樣品總質(zhì)量的11.16%；用HPLC檢測法得到8種主要兒茶素總量和咖啡堿的質(zhì)量分別為0.194?8?mg和0.055?7?mg，在綠茶乳酪中的占比為68.59%和19.61%（圖1-A）。發(fā)現(xiàn)兒茶素類和咖啡堿占綠茶乳酪總質(zhì)量的88%以上，是綠茶冷后渾的主要成分。比較綠茶乳酪中主要兒茶素的含量，發(fā)現(xiàn)酯型兒茶素的含量更高，其中EGCG和ECG占兒茶素總質(zhì)量的3/4以上（圖1-B）。

2.2 綠茶乳酪簡化體系的組成

選取綠茶乳酪中具有代表性的酯型和非酯型兒茶素，與咖啡堿建立簡化體系CATs-CAF，研究體系中上清液和沉淀的物質(zhì)分布及含量，結(jié)果如表2所示。在參與反應(yīng)的咖啡堿足量情況下，4種等摩爾比兒茶素（EC、ECG、EGC、EGCG）在沉淀中的分配比例約為1∶2∶1∶2?？梢钥闯?，簡單兒茶素與酯型兒茶素的分配比例約為1∶2，而結(jié)構(gòu)相近的兒茶素絡(luò)合參與度大致相同。

表1 晶體學(xué)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖1 綠茶乳酪中各物質(zhì)含量

2.3 絡(luò)合物晶體的掃描電鏡結(jié)構(gòu)

分別在放大500倍和5?000倍下觀察晶體的顯微形貌及顆粒大小，發(fā)現(xiàn)晶體呈不規(guī)則分布。CAF晶體呈針狀且表面光滑，顆粒大小不均（直徑0.5~10?μm）。EC晶體呈無定形塊狀且表面粗糙，ECG晶體呈針狀且表面光滑。EC和ECG分別與CAF絡(luò)合形成的晶體（EC-CAF、ECG-CAF）均為針狀且表面光滑（圖2）。

2.4 絡(luò)合物晶體的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)

通過X射線晶體學(xué)手段，進(jìn)一步研究絡(luò)合物晶體的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。

試驗結(jié)果表明，EC和CAF以1∶1絡(luò)合，結(jié)晶于單斜晶系2空間群，形成針狀晶體EC-CAF。單個晶粒尺寸為0.1?mm×0.008?mm×0.006?mm，其晶胞尺寸為a=27.241?3(6)??，b=6.665?8(2)??，c=17.340?7(4)??。1個晶胞包含4個EC-CAF絡(luò)合單元，每個絡(luò)合單元中，EC的A環(huán)和CAF的六元環(huán)面對面（圖3）。

進(jìn)一步分析分子之間的作用力，發(fā)現(xiàn)絡(luò)合物結(jié)構(gòu)通過氫鍵和π-π堆積相互作用維持（圖4）。EC可與相鄰的EC和CAF形成O-H...O型氫鍵；通過EC分子中A環(huán)與CAF的六元環(huán)之間形成的面對面π-π堆積相互作用，絡(luò)合單元在與b軸相同的方向上平行堆疊。每個EC分子平均結(jié)合1個CAF分子，因此EC-CAF的絡(luò)合比例為1∶1。

表2 CATs-CAF中上清液和沉淀的物質(zhì)分布及含量

注：表中數(shù)據(jù)為3個重復(fù)平均值，同一行標(biāo)注字母不同者差異顯著（＜0.05）

Note: Each value was the mean of three replicates. Different letters within a column indicate a significantly different (＜0.05)

圖2 掃描電鏡（SEM）下的晶體形貌

ECG和CAF以2∶4絡(luò)合，結(jié)晶于單斜晶系P21空間群，形成針狀晶體ECG-CAF。單個晶粒尺寸為0.28?mm×0.19?mm×0.14?mm，其晶胞尺寸為a=13.980?7(7)??，b=8.978?3(4)??和c=31.836?4(16)??。一個晶胞包含兩個不完全對稱的ECG-CAF絡(luò)合單元Ⅰ和Ⅱ，以及12個作為晶體溶劑的水分子，每個絡(luò)合單元中，ECG的D環(huán)和CAF的六元環(huán)交替出現(xiàn)，但Ⅰ中存在明顯錯位（圖5）。ECG的D環(huán)與CAF的六元環(huán)沿a軸方向依次排列（圖6）；ECG的A環(huán)和B環(huán)分別與CAF的六元環(huán)相對，沿c軸方向延伸（圖7-B）。

進(jìn)一步分析分子之間的作用力，發(fā)現(xiàn)絡(luò)合物結(jié)構(gòu)通過氫鍵和π-π堆積相互作用維持（圖8）。ECG可與相鄰的ECG和CAF形成O-H...O型及O-H...N型氫鍵；ECG的A環(huán)，B環(huán)和D環(huán)均與相鄰CAF的六元環(huán)產(chǎn)生面對面π-π堆積相互作用。

在a軸方向上，D環(huán)和CAF存在左右交錯和上下交疊兩種排列方式，這兩種排列方式沿c軸依次出現(xiàn)，每個ECG的D環(huán)平均可與1個CAF的六元環(huán)配對（圖6）。

注：A：EC-CAF晶胞；B：EC-CAF層結(jié)構(gòu)

注：虛線表示氫鍵，雙箭頭表示面對面的π-π堆積相互作用

3 討論

關(guān)于綠茶乳酪的化學(xué)組成，大量研究表明茶多酚和咖啡堿是綠茶乳酪的重要組分[4-5,8-9]，其中茶多酚占綠茶乳酪總質(zhì)量的78.66%，兒茶素類是多酚參與乳酪形成的主體成分[4]，咖啡堿和兒茶素（尤其是酯型兒茶素）是決定綠茶乳酪形成的關(guān)鍵化學(xué)組分[5,8]。本研究中，兒茶素和咖啡堿為綠茶乳酪的主要組成物質(zhì)，占乳酪總質(zhì)量的88%以上，是綠茶“冷后渾”形成的關(guān)鍵化學(xué)成分，其中，酯型兒茶素更容易參與綠茶乳酪的形成，與前人的研究結(jié)果一致。而綠茶乳酪簡化體系CATs-CAF試驗則進(jìn)一步表明，簡單兒茶素與對應(yīng)結(jié)構(gòu)的酯型兒茶素在乳酪沉淀中的分配比例約為1∶2，說明不同兒茶素的結(jié)構(gòu)差異可能對茶乳酪的形成有較大影響。

注：A：ECG-CAF晶胞；B：晶胞a軸方向俯視圖

注：雙箭頭表示面對面的π-π堆積相互作用

注：A：ECG和CAF之間的π-π堆積相互作用；B：BC平面俯視圖

注：虛線表示氫鍵，雙箭頭表示面對面的π-π堆積相互作用

本試驗中，兒茶素與咖啡堿絡(luò)合形成白色針狀單晶EC-CAF和ECG-CAF。結(jié)合X-射線單晶衍射手段對晶體的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)EC-CAF，ECG-CAF均通過分子間氫鍵和面對面π-π堆積作用絡(luò)合，但非酯型兒茶素EC和酯型兒茶素ECG與CAF的作用部位有所差異：EC可與相鄰的EC、CAF分子形成O-H...O型氫鍵，面對面π-π堆積作用僅發(fā)生在EC的A環(huán)與CAF的六元環(huán)之間，形成1∶1絡(luò)合物EC-CAF；而ECG可與相鄰的ECG、CAF分子形成O-H...O以及O-H...N型氫鍵，且ECG的所有芳香環(huán)都能與CAF的六元環(huán)互作，形成2∶4絡(luò)合物ECG-CAF，這與Sato等[22]的研究結(jié)果相似。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)ECG的D環(huán)和CAF的六元環(huán)在a軸方向上并非簡單的依次排列，而是存在左右交錯和上下交疊兩種排列方式，這兩種排列方式沿c軸交替出現(xiàn)；ECG的A環(huán)、B環(huán)分別與相鄰ECG的B環(huán)和另一個ECG的A環(huán)在BC平面共用不同CAF的六元環(huán)；平均每個ECG的D環(huán)可與1個CAF配對，A環(huán)或B環(huán)分別絡(luò)合1/2個CAF，即1個ECG分子能結(jié)合2個CAF分子，再根據(jù)其最小重復(fù)單元得出ECG-CAF的絡(luò)合比例為2∶4。

本研究分析了綠茶乳酪簡化體系CATs-CAF的宏觀分配比例及微觀結(jié)構(gòu)特性。發(fā)現(xiàn)EC和ECG均與CAF形成氫鍵和面對面π-π堆積作用，并可以在一定方向上堆疊晶胞；EC-CAF和ECG-CAF的絡(luò)合比例分別為1∶1和2∶4，這與CATs-CAF中EC∶ECG≈1∶2的結(jié)果相對應(yīng)，進(jìn)一步揭示了ECG相對于EC更容易和咖啡堿進(jìn)行絡(luò)合的機(jī)理，為探明綠茶冷后渾的形成機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Crystallographic Study on the Complex of Catechins and Caffeine

DONG Yanru, CAO Yanyan, LU Jiachun, MEI Sifan, HE Run, CHEN Ping*

Tea Research Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Through HPLC analysis, it was found that catechins and caffeine accounted for more than 88% of the total mass of green tea cream. The CATs-CAF, a simplified green tea cream system, was established by two ester catechins that with the highest content in green tea cream, and their corresponding non-ester catechins complexed with caffeine. The distribution ratio of 4 catechins in precipitate was that EC∶ECG∶EGC∶EGCG≈1∶2∶1∶2. Single crystals were prepared by complexing ECG and EC respectively with caffeine and observed under scanning electron microscopy to record their micro-morphology before and after complexation. Using X-ray single-crystal diffraction to analyze the stereochemical structure, the results show that two needle crystals were formed by intermolecular hydrogen bonding and face-to-face π-π stacking. EC formed O-H...O type hydrogen bonds with adjacent EC and CAF molecules, and π-π stacking occurred between the A ring of EC and the six-membered ring of CAF to form a 1∶1 complex of EC-CAF. While the ECG could form O-H...O and O-H...N type hydrogen bonds with adjacent ECG and CAF molecules, and the π-π stacking of ECG-CAF occurred among all aromatic rings to form a 2∶4 complex, in which the ring A and B of each ECG shared the six-membered ring of CAF separately with the ring B and A of the adjacent ECGs, while the D ring of ECG and the six-membered ring of CAF extended on the a axis in two arrangements.

tea cream, complexation mechanism, scanning electron microscope, X-ray single crystal diffraction

S571.1；O723+.6

A

1000-369X(2021)01-080-10

2020-05-06

2020-07-21

董燕茹，女，碩士研究生，主要從事制茶工程與品質(zhì)鑒定研究，21716063@zju.edu.cn。*通信作者：pingchen@zju.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）