王蔚，陳琳，王偉偉，張建勇，江和源*

茶葉有效成分對黑色素形成的抑制作用

王蔚1,2，陳琳1,2，王偉偉1，張建勇1，江和源1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室 浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081

黑色素是一種高分子生物色素，皮膚的顏色由黑色素的合成類型、累積量、黑素小體的再分布及降解決定。太陽紫外線輻射是導致黑色素形成過多的最常見因素。黑色素雖能保護皮膚細胞免受紫外線損傷，但異常積累將會導致黑色素紊亂疾病的發(fā)生。因此開發(fā)綠色、安全、高效的植物來源的黑色素抑制劑成為近年來研究的熱點。不少研究表明茶葉提取復合物或茶葉單體成分可明顯降低酪氨酸酶活性，減緩黑色素細胞的生長增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移，抑制皮膚癌發(fā)生等。通過對茶葉有效成分在非細胞酪氨酸酶測試系統(tǒng)、細胞測試系統(tǒng)、動物模型以及人體皮膚中抑制黑色素形成的研究進展進行綜述，以期充分挖掘茶葉中主要有效成分抑制黑色素的形成及其相應的作用機制，開發(fā)一種安全高效的黑色素合成抑制劑，并為實現(xiàn)茶產(chǎn)品的綜合利用、提高茶產(chǎn)業(yè)附加值提供思路。

茶葉有效成分；黑色素；非細胞酪氨酸酶測試系統(tǒng)；細胞測試系統(tǒng)；動物模型；人體皮膚

黑色素是一種高分子生物色素，不溶于水，但可溶于堿性溶液，是一種類似于多酚的蛋白質(zhì)衍生物。在黑色素細胞內(nèi)部，黑色素合成并儲存于組織特異、與溶酶體相關(guān)的、被稱為黑素小體的專門細胞器中[1]。黑色素合成后，隨黑素小體逐步轉(zhuǎn)移到黑色素細胞的樹突末端，隨后進入周圍的角質(zhì)形成細胞并在其中重新排列分布[2-3]。黑色素通常以聚合形式存在于動物皮膚或毛發(fā)中，甚至植物與原生生物都有這種色素，其種類、含量、物理和化學性質(zhì)、分布等會直接影響皮膚、頭發(fā)和眼睛的顏色[4-6]。黑色素的形成受多種因素的影響，如紫外線、自由基、情緒壓力等，受任一因素影響而引起的黑色素合成的紊亂，都將導致一系列色素代謝障礙性疾病的發(fā)生[7]，其中紫外線是影響皮膚生物學效應的重要外界物理因素，作為一種強烈的外源性促細胞分裂劑，能引起黑色素細胞的增殖或凋亡，以及黑色素合成的增加[8-9]。黑色素的存在有利有弊。當紫外線照射到皮膚上，肌膚就會處于“自我防護”的狀態(tài)，通過物理吸收光波，并經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導通路激活酪氨酸酶的活性，通過產(chǎn)生黑色素來保護皮膚免受紫外輻射的侵害[10-11]；黑色素還能保護皮膚和眼睛免受有害物質(zhì)的侵害，保護包括皮膚、眼睛、大腦在內(nèi)的多個器官系統(tǒng)功能的正常運行[12]，且已被證明能夠通過其羧基和酚羥基有效地結(jié)合金屬離子，從而有助于隔離潛在的有毒金屬離子和保護剩余細胞[13]。此外，黑色素在有機體適應環(huán)境的過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14]。但是黑色素在表皮基底層的異常蓄積會造成曬斑、雀斑、老年斑等皮膚斑，影響審美及人們的生活質(zhì)量，也極大地增加了患惡性黑色素瘤這一轉(zhuǎn)移性強、惡性度高的皮膚癌癥的風險[15]。

對黑色素細胞早期的研究始于1837年捷克生理學家Purkyne在對腦緣皮質(zhì)細胞研究中發(fā)現(xiàn)的黑色素顆粒[16]。1840年瑞典著名生理學家Berzelius首次將黑色素正式命名為melanin[17]。1954年Richter開始從化學分析的角度對不同形態(tài)的黑色素進行研究。1972年Duchon對黑色素顆粒的物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)以及性質(zhì)進行了研究，并提出黑色素是由多種蛋白質(zhì)的色素顆粒構(gòu)成。近年來，一些色素性疾病的研究以及市場上關(guān)于美白添加劑的開發(fā)使得黑色素的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能、合成調(diào)控、以及遷移沉積成為研究熱點[18-19]。

抑制黑色素合成的研究可以從抑制酪氨酸酶活性、通過細胞信號干預黑色素生成、阻礙黑色素從黑色素細胞向角質(zhì)形成細胞的轉(zhuǎn)移等方面開展。目前，在抑制黑色素過度合成方面，醫(yī)藥與化妝品行業(yè)研究最多的是酪氨酸酶抑制劑，如：苯二酚、氫醌、曲酸等，但是這些物質(zhì)普遍具有刺激性和細胞毒性，以其制成的藥物或美白添加劑往往穩(wěn)定和皮膚滲透能力差、活性不足，易造成皮炎和永久性脫色，甚至具有致癌風險。隨著社會經(jīng)濟和科技水平的發(fā)展，人們對于醫(yī)藥以及化妝品的要求也不斷提高，對人體健康無負面影響，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等特性的植物來源美白添加劑逐漸受到青睞。其中，茶葉提取物中的多種成分具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥和抗心腦血管疾病等諸多的生物活性[20-22]，近年來對茶葉提取物的美白作用研究也越來越多。前期研究證明，茶葉提取復合物或茶葉單體成分具有較強的抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素細胞的生長增殖浸潤轉(zhuǎn)移、抑制紫外線（UVB）誘導皮膚致癌并為皮膚提供光保護等作用。因此，以茶葉為原料開發(fā)預防、治療黑色素瘤的藥物或淡化色斑改善皮膚顏色的護膚品、化妝品具有廣闊的應用前景。本文通過對茶葉有效成分在非細胞酪氨酸酶測試系統(tǒng)、細胞測試系統(tǒng)、動物模型以及人體皮膚中抑制黑色素形成的研究進展進行綜述，以期充分挖掘茶葉中抑制黑色素形成的主要有效成分及其作用機制，找到一種安全高效的黑色素合成抑制劑，并為實現(xiàn)茶產(chǎn)品的綜合利用、提高茶產(chǎn)業(yè)附加值提供思路。

1 對體外酪氨酸酶活性的抑制作用

茶及茶葉提取復合物可以抑制體外酪氨酸酶活性。劉錦梅等[23]比較了綠茶、鐵觀音、花茶和普洱茶4種茶類4.0?mg·mL-1（以生藥計）的醇提物對馬鈴薯酪氨酸酶活性的抑制率，結(jié)果表明鐵觀音（62.28%）對酪氨酸酶活性的抑制率最強，其次依次為花茶（34.76%）、普洱茶（29.00%）和綠茶（9.50%）。沈曉佳等[24]研究發(fā)現(xiàn)紫娟茶的3種提取物對蘑菇酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性均有較好的抑制作用，特別是含有花青素和茶多酚混合物的提取物Ⅰ的抑制作用最強。劉婧等[25]通過建立的酪氨酸酶抑制效果評價體系來研究不同添加量的超綠活性茶粉對酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果表明，超綠活性茶粉添加量為4%時，對酪氨酸酶的抑制效果最好，抑制率達到20.85%，表明其可作為美白化妝品的添加劑。傅佳愈等[26]研究了茶花粉提取物對酪氨酸酶的抑制作用。結(jié)果表明，茶花粉提取物抑制酪氨酸酶活性的能力和多酚、黃酮類化合物的含量呈中度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.404和0.400，但均不顯著（>0.05）。劉林剛等[27]研究表明，茶多酚在濃度為2?mmol·L-1時對蘑菇酪氨酸酶的活性表現(xiàn)出較強的抑制作用，顯著強于0.5?mmol·L-1的氫醌。Hong等[28]評估了單寧酶轉(zhuǎn)化綠茶提取物對皮膚物理穩(wěn)定性和相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明，當用單寧酶處理時，綠茶提取物中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）的濃度大幅度下降到可以忽略不計的水平。相較于5%常規(guī)綠茶提取物，5%單寧酶轉(zhuǎn)化綠茶提取物顯著抑制了胰肽酶E、蘑菇酪氨酸酶的活性（<0.05），且后者在16周內(nèi)表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的pH、沉淀、顏色特性。

此外，茶葉單體成分，如兒茶素類、茶黃素類、茶皂素等都被證明可以抑制體外酪氨酸酶活性。官興麗[29]研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素能抑制馬鈴薯和蘑菇酪氨酸酶的活性中心，導致酶活性下降，與底物左旋多巴競爭酶，降低酶促反應的效率。No等[30]評價了10種韓國傳統(tǒng)茶（Oolong、boxthorn、green tea等）和綠茶中的主要組分（ECG、GCG、EGCG等）對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。結(jié)果表明，綠茶中抑制酪氨酸酶活性的主要活性成分為ECG、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）和EGCG，且以GCG的抑制效果最好。ECG、GCG和EGCG都是以沒食子酸為活性部位的兒茶素類。對酪氨酸酶抑制的動力學分析揭示了GCG取代-酪氨酸而結(jié)合在酪氨酸酶活性部位，GCG與-酪氨酸存在競爭性關(guān)系。梁慧玲等[31]研究中使用了3種茶葉提取物，其中茶提物1中兒茶素類總量為97.33%，EGCG、表兒茶素（Epicatechin，EC）、ECG、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、兒茶素（Catechin，C）含量分別為54.51%、16.38%、13.46%、11.46%、1.52%；茶提物2只含有90.10%的EGCG；茶提物3中兒茶素類總量為21.73%，各單體含量均小于茶提物1中對應組分的含量，茶黃素類總量為36.80%。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶提物3對蘑菇酪氨酸酶的抑制率最大，其次是茶提物1，茶提物2最小，因此推斷茶黃素類對酪氨酸酶的抑制率遠大于兒茶素類。周盈利等[32]研究茶黃素（Theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavins-3-gallate，TF2A）、茶黃素-3′-沒食子酸酯（Theaflavins-3′-gallate，TF2B）、茶黃素雙沒食子酸酯（Theaflavins-3,3′-gallate，TF3）和茶黃酸（Theaflavic acid，TF4）5種單體化合物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，并與陽性對照EGCG進行比較。結(jié)果顯示，5種茶黃素單體對酪氨酸酶活性有不同程度的抑制作用，且存在量效關(guān)系。除茶黃酸外，其他4種茶黃素單體對酪氨酸酶活性的抑制作用均高于EGCG。孫勁毅等[33]研究了茶皂素對馬鈴薯酪氨酸酶活性的抑制作用，質(zhì)量濃度為100?g·L-1時，市售茶皂素、經(jīng)大孔樹脂純化的茶皂素TS及2種層析分離得到的茶皂素TS1和TS2對酪氨酸酶的抑制率分別為51.29%、90.06%、94.13%和82.47%；TS和TS1對酪氨酸酶IC50分別為48?g·L-1和40?g·L-1，抑制作用表現(xiàn)為可逆競爭性抑制，對酪氨酸酶的抑制常數(shù)分別為137?g·L-1和101?g·L-1。

綜上可見，在非細胞酪氨酸酶測試系統(tǒng)中，茶及茶葉提取復合物、茶葉單體成分均能抑制體外酪氨酸酶的活性，主要通過抑制酪氨酸酶的活性中心[29]及與底物競爭酪氨酸酶[29-30]發(fā)揮作用。

2 對細胞模型中黑色素合成的抑制作用

在細胞測試系統(tǒng)中，目前常用的細胞類型包括永生化黑色素細胞、黑色素瘤細胞、人表皮黑色素細胞、人表皮角質(zhì)形成細胞。

2.1 對永生化黑色素細胞或黑色素瘤細胞模型中黑色素合成的抑制作用

在以永生化黑色素細胞或者黑色素瘤細胞為研究對象的試驗中，Kim等[34]研究發(fā)現(xiàn)紅茶、綠茶和白茶水提物能夠抑制永生化黑色素細胞中黑色素沉積和樹突形成。當質(zhì)量濃度為12.5?μg·mL-1時，紅茶水提物和白茶水提物抑制黑色素生成的效果優(yōu)于同等濃度的EGCG（對照），且紅茶效果最佳，但3種茶水提物對黑色素生成的抑制作用均優(yōu)于曲酸（Kojic acid，KA）和熊果苷（Arbutin，AT）。此外，紅茶、綠茶和白茶水提物以濃度依賴的方式抑制細胞內(nèi)酪氨酸酶活性。許蘭等[35]研究表明，茶樹花提取物可以通過改變細胞形態(tài)、抑制細胞增殖、抑制酪氨酸酶活性、減少黑色素生成等途徑達到美白效果，并呈一定的劑量依賴性。陳貞純等[36]研究表明，茶黃素單體（TF1）、EGCG、純度為40%的茶黃素（TF40）對B16黑色素瘤細胞形態(tài)有不同程度的影響，對細胞活性、酪氨酸酶濃度和黑色素合成量有濃度依賴性抑制作用。張向娜[3]研究表明茶葉提取物EGCG、GCG、ECG能改變B16F10小鼠黑色素瘤細胞的形態(tài)，抑制細胞增殖率、細胞內(nèi)酪氨酸酶活性以及黑色素的生成量，下調(diào)黑色素生成相關(guān)基因（MITF、TYR、TRP-1、TRP-2）的表達，并通過降低細胞內(nèi)cAMP的水平來下調(diào)黑色素生成相關(guān)蛋白（CREB1、p-CREB1、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白）的表達，以此發(fā)揮美白功效。相同濃度條件下，EGCG、GCG、ECG的美白效果優(yōu)于熊果苷，且ECG效果最優(yōu)，其次為EGCG，再次是GCG。Kim等[37]研究表明，在不產(chǎn)生細胞毒性的情況下，100?μmol·L-1的EGCG顯著降低B16F10細胞分泌和合成的黑色素含量。50?μmol·L-1的EGCG雖然不影響細胞的黑色素分泌量，但是顯著降低了細胞內(nèi)黑色素合成量。張欣等[38]研究結(jié)果表明，茶氨酸衍生物茶溴香酰胺脂質(zhì)體（TBrC-L）以劑量依賴的方式對黑色素瘤B16細胞的生長和遷移產(chǎn)生顯著性抑制作用，并且誘導其凋亡。TBrC-L可下調(diào)c-Met、HGF、Bcl-2、NF-B和VEGFR2的表達，上調(diào)Caspase-3、E-cadherin、Bax、p53和Cytochrome c的表達，因此抑制HGF/Met/VEGFR2-NF-κB通路可能是TBrC-L抑制B16細胞生長和遷移的重要分子機制。

2.2 對人表皮黑色素細胞中黑色素合成的抑制作用

在以人表皮黑色素細胞為研究對象的試驗中，岳學狀[39]研究發(fā)現(xiàn)5.0~20.0?μg·mL-1的EGCG對體外培養(yǎng)的人黑色素細胞的黑色素含量和酪氨酸酶活性具有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴性。

2.3 對人表皮角質(zhì)形成細胞中黑色素合成的抑制作用

雖然黑素小體形成是黑化過程中的關(guān)鍵步驟，但黑素小體必須從黑色素細胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細胞才能發(fā)揮相應的作用，呈現(xiàn)對應的顏色，并促進黑色素的進一步生成。成熟的黑素小體沿著微管、微絲運動到黑色素細胞的樹突上，再通過樹突狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到周圍的角質(zhì)形成細胞中，并在其中重新排列分布。因此黑色素顆粒會隨角質(zhì)形成細胞的分化向上遷移，最終在角質(zhì)層中積累，黑色素在角質(zhì)層中的積累構(gòu)成了可見的色素沉積[3]。因此，已有不少研究者對人表皮角質(zhì)形成細胞進行了相關(guān)研究。

轉(zhuǎn)錄因子中的激活蛋白1（Activator protein 1，AP1）家族在細胞增殖和存活中起著重要作用[40]。Chen等[41]證明，用EGCG處理人角質(zhì)形成細胞株（HaCaT）后，UVB誘導的c-（AP-1的一種異二聚體）表達降低。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-B是一種廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Rel家族。它可以被紫外線輻射所刺激，并參與炎癥、免疫、細胞周期進展、凋亡和腫瘤發(fā)生等多個過程[42-43]。經(jīng)EGCG處理后，紫外線誘導的人類表皮角質(zhì)形成細胞中IKBa降解和磷酸化受到抑制，IKKa以特定劑量和時間的方式被激活，表明EGCG可以抑制NF-B激活所導致的一些有害生物后果[44]。

外皮蛋白（Human involucrin，hINV）是一種角質(zhì)形成細胞分化標志物，由AP1轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控[45]。Balasubramanian等[45]指出，EGCG通過增加hINV、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1型（Transglutaminase type 1，TG1）和caspase-14基因的表達而促進正常人角質(zhì)形成細胞的分化，這可能是使突變細胞從表皮中去除的一種機制。EGCG促進hINV表達的作用是通過激活nPKC、Ras、MEKK1、MEK3、p38δ-ERK1/2信號級聯(lián)反應而介導的，進而增加AP1轉(zhuǎn)錄因子的表達，并增強該因子與hINV啟動子AP1-1位點的結(jié)合以激活hINV基因的表達。EGCG處理后，角質(zhì)形成細胞的形態(tài)也會發(fā)生改變。EGCG可抑制角質(zhì)形成細胞的增殖，但不會誘導其凋亡。EGCG在正常和永生化（或形態(tài)性質(zhì)發(fā)生改變的細胞）角質(zhì)形成細胞中會引起不同的反應。在正常角質(zhì)形成細胞中，EGCG增加AP1因子表達水平，而在永生化細胞中EGCG則降低AP1因子表達水平。這表明EGCG的活性和作用機制在疾病發(fā)展過程中可能發(fā)生變化。

2.4 對細胞混合培養(yǎng)模型中黑色素合成的抑制作用

蘭海龍等[46]以包皮組織作為細胞來源，體外構(gòu)建黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞直接接觸的混合培養(yǎng)模型，檢測蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后對黑色素細胞酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響，發(fā)現(xiàn)3種褪色劑均對黑色素細胞酪氨酸酶活性及黑色素合成產(chǎn)生濃度依賴性抑制，茶多酚作用最強，蘆薈苦素次之。

總的來說，在細胞測試系統(tǒng)中，茶葉提取復合物及單體成分對黑色素合成的抑制作用主要通過改變黑色素瘤細胞形態(tài)[3,35]、抑制黑色素瘤細胞增殖[3,35]、抑制黑色素瘤細胞內(nèi)酪氨酸酶活性[3,34-35]、減少黑色素生成和積累[3,34]、減少樹突傳遞黑色素量[34]、抑制永生化角質(zhì)形成細胞的增殖[45]、促進正常人角質(zhì)形成細胞的分化[45]等來實現(xiàn)。

3 對動物模型中UVB誘導的皮膚致癌及黑色素合成的抑制作用

皮膚癌主要分為黑色素瘤和非黑色素瘤兩大類[47]。太陽紫外線輻射是導致色素異常積累和皮膚癌等皮膚問題的最常見因素[48-49]。雖然皮膚被賦予內(nèi)源性防御系統(tǒng)，以限制太陽紫外線輻射對皮膚造成的有害影響，如角質(zhì)層的光散射、黑色素對光的吸收、抗氧化防御方法的存在以及修復酶修復紫外線損傷的DNA等，然而這些內(nèi)生的光保護手段不能完全抵消過度曝露于紫外線輻射下產(chǎn)生的所有不利影響[50]。因此開發(fā)可以抑制紫外線誘導的皮膚致癌或為皮膚提供光保護的天然成分顯得尤為重要。

3.1 茶葉有效成分可以抑制UVB誘導的皮膚致癌

研究表明，口服常規(guī)茶（未脫咖啡堿的綠茶和紅茶）可以抑制UVB誘導的SKH-1小鼠皮膚癌變。常規(guī)茶對UVB誘導皮膚癌變的抑制活性強于脫咖啡堿茶（脫咖啡堿綠茶、脫咖啡堿紅茶），在脫咖啡堿的茶中添加咖啡堿可恢復這些茶對癌變的抑制作用[51]。在以DMBA（7,12-二甲基苯并蒽）激活的SKH-1小鼠為動物模型的試驗中，口服高劑量（1.25%的水提液）的脫咖啡堿茶可以抑制小鼠皮膚癌變，雖然其效果低于常規(guī)茶[52]。而在UVB誘導完全癌變的小鼠模型中，口服低劑量的脫咖啡堿茶只能輕微抑制甚至不能抑制UVB誘導的完全癌變，口服高劑量（1.25%的水提取液）的脫咖啡堿茶反而促進UVB的皮膚致癌作用[51]，造成兩者差異的原因尚不清楚。但是兩個試驗都證明咖啡堿是茶葉中對UVB誘導的皮膚癌變起抑制作用的重要組分。

Lu等[53]用UVB（30?mJ·cm-2）照射SKH-1無毛小鼠，每周兩次，持續(xù)22周后，不再進行UVB照射，這些無瘤小鼠在未來幾個月內(nèi)具有很高的發(fā)生惡性和非惡性皮膚腫瘤的風險，稱為高風險小鼠。在停止UVB照射后，高風險小鼠口服綠茶、紅茶或咖啡堿23周，可以減少患腫瘤的小鼠數(shù)量，減小子宮旁脂肪墊的大小，并降低非腫瘤和腫瘤下的真皮脂肪層的厚度。服用不含咖啡堿的茶對以上參數(shù)幾乎沒有影響，在脫咖啡堿的茶中添加咖啡堿（相當于常規(guī)茶中的咖啡堿的含量）可以恢復其抑制作用。在所有試驗組中，腫瘤下的真皮脂肪層比非腫瘤區(qū)的薄，大腫瘤下的真皮脂肪比小腫瘤下的少，顯示腫瘤下的真皮脂肪可能是腫瘤的能量來源。飲用含咖啡堿飲料可以降低腫瘤下，特別是大腫瘤下的真皮脂肪層厚度。這是第一次證明化學預防劑通過降低組織脂肪水平來抑制癌變，從而指出咖啡堿是常規(guī)含咖啡堿茶發(fā)揮降低組織脂肪水平和減少癌癥發(fā)生作用的關(guān)鍵成分。值得注意的是，常規(guī)的含咖啡堿茶和咖啡堿對體脂形成（通過參考脂肪墊大小和皮膚脂肪厚度的變化來衡量）和腫瘤發(fā)生的抑制作用是在不影響體重或食物消耗的情況下發(fā)生的。

Conney等[54]研究發(fā)現(xiàn)口服綠茶、咖啡或咖啡堿溶液2周可增強UVB誘導SKH-1小鼠表皮細胞的凋亡，但該處理對沒有被UVB照射的正常表皮細胞無明顯影響，因此口服綠茶、咖啡和咖啡堿可至少部分地通過增強UVB誘導的細胞凋亡來抑制UVB誘導的癌變。在UVB照射前（0.5?h）將咖啡堿外涂于皮膚上具有防曬效果，可以抑制UVB誘導的胸腺嘧啶二聚體形成，并抑制UVB誘導的皮膚曬傷。單次UVB照射后立即外涂咖啡堿可增強UVB誘導的表皮細胞凋亡，但這種處理對正常表皮、表皮彌漫性增生區(qū)和荷瘤小鼠表皮中遠離腫瘤的區(qū)域沒有影響[55]。此外，外涂咖啡堿可抑制UVB預處理20周的小鼠（無腫瘤的高風險小鼠）體內(nèi)腫瘤的形成，促進腫瘤細胞的凋亡，但同樣地對遠離腫瘤的表皮細胞無抑制作用[54]。這些結(jié)果表明，咖啡堿對DNA損傷組織和腫瘤有選擇性促凋亡作用，不會影響正常組織。

每周兩次用UVB照射小鼠，在這個過程中，口服咖啡堿可以：（1）抑制表皮細胞中早期斑塊的形成；（2）改變p53陽性斑塊中UVB誘導的p53基因突變的表達譜；（3）抑制UVB誘導的癌變。將咖啡堿外涂于UVB預處理的高風險小鼠（造模后不再進行UVB照射）：（1）促進了表皮中突變型p53陽性細胞斑的清除；（2）選擇性地降低了在p53基因中有一個純合突變的斑塊的比例；（3）抑制了UVB誘導的癌變[55]。生物學上將p53分為野生型和突變型兩類。野生型p53基因是一種常規(guī)的抑癌基因，其編碼的蛋白可對細胞周期進行調(diào)控，使得DNA受損的細胞難以由G1期進人S期或者由G2期進入M期，從而抑制腫瘤細胞的增殖[56]。相關(guān)研究表明，咖啡堿提高了野生型p53基因的表達[57]，并通過一個p53、bax非依賴性機制[58]來增強UVB誘導的小鼠表皮細胞凋亡。

3.2 茶葉有效成分可以為皮膚提供光保護

Choi等[59]為評價紅茶水提取物（Black tea water extract，BT）的美白效果，將BT涂于棕色豚鼠（450~500?g）背部皮膚上，并經(jīng)UVB（1?500?mJ·cm-2）照射誘導產(chǎn)生的人工色素沉著斑點。試驗通過檢測總多酚含量和總黃酮含量，比較了EGCG、BT、氫醌（Hydroquinone，HQ）、KA及AT的抗氧化能力。動物試驗分組如下：正常組（無處理組，N）、對照（UVB+生理鹽水，C）、空白對照[UVB+丙二醇：乙醇：水（5︰3︰2），VC]、陽性對照（UVB+2%氫醌，PC）、試驗組1（UVB+1% BT，BT1）、試驗組2（UVB+2% BT，BT2）。試驗化合物為30?μL，每天2次，每周5天，連續(xù)4周。用藥4周后，在麻醉條件下用活檢穿孔器摘除斑點，作為組織學檢查的樣品。結(jié)果顯示，5種樣品的抗氧化能力為：EGCG>BT>HQ>KA>AT（BT顯著高于KA和AT，略高于氫醌），說明BT具有較高的抗氧化活性。通過肉眼觀察和組織學檢查，BT脫色能力低于PC。在用藥的第4周，與N組相比，C組和VC組中的黑色素沉著顯著增加，并且覆蓋整個表皮。與C組相比，PC、BT1和BT2組中的黑色素分散明顯減少，并且主要局限于基底層。與C組和VC組相比，PC、BT1與BT2組的黑色素指數(shù)顯著下降（<0.001），且顯著抑制了黑色素沉著、黑色素細胞增殖和黑素小體合成。綜上，BT通過減少黑色素沉著來消除棕色豚鼠中由UVB刺激產(chǎn)生的延遲曬斑，而黑色素沉著減少又是通過抑制黑色素細胞的增殖和黑素小體的合成來實現(xiàn)。

汪建等[60]研究了茶多酚經(jīng)皮給藥對小鼠皮膚中酪氨酸酶活性的影響。試驗中，小鼠根據(jù)用藥時間不同分為3組（用藥1?h、7?d和14?d），小鼠脫毛皮膚處每次涂抹0.3?g 3%的茶多酚膏劑，用藥7?d和14?d組每日早晚各涂1次。其后，取皮測定其中酪氨酸酶、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的變化。結(jié)果表明，3組小鼠皮膚中酪氨酸酶活性均被顯著抑制，但是MDA和SOD活性沒有顯著變化。說明茶多酚能夠透皮吸收，強烈抑制酪氨酸酶的活性，但不會過多干擾正常皮膚的其他氧化還原代謝，這有利于維持皮膚的組織更新。

4 茶葉有效成分對人體皮膚中黑色素合成的抑制作用

茶葉提取復合物及茶葉單體成分主要通過抑制紫外線照射誘導的皮膚紅斑形成、黑色素指數(shù)（Melanin index，MI）增加、曬傷細胞形成、表皮Langerhans細胞損耗和皮膚表皮增厚來為皮膚提供光保護。

Elmets等[61]以人類皮膚為試驗對象，未曬黑的背部先外涂EGCG處理30?min，然后進行急性紫外線照射。結(jié)果表明，EGCG顯著抑制紫外線照射誘導的皮膚紅斑形成、曬傷細胞形成和表皮Langerhans細胞損耗。

Li等[62]以20名志愿者為試驗對象研究了綠茶提取物對經(jīng)紫外線照射的人體皮膚的保護作用。在進行紫外線照射前，志愿者背部的5處皮膚分別被涂抹2%~5%綠茶提取物，然后反復照射人工模擬的太陽UVR。結(jié)果顯示，紫外線照射使皮膚產(chǎn)生紅斑、MI增加并且皮膚表皮增厚，而綠茶提取物可以抑制紫外線對皮膚產(chǎn)生的不良影響，但并不呈濃度依賴性（相較于更高濃度，2%和3%的綠茶提取物具有更佳的光保護效果）。

5 總結(jié)與展望

大量體內(nèi)外試驗證明，茶葉提取復合物或單體成分可以有效減少黑色素的合成、沉積以及黑色素瘤的發(fā)生。至今，關(guān)于茶葉對黑色素紊亂疾病調(diào)控的研究，涉及了體外酪氨酸酶、黑色素瘤細胞、正常黑色素細胞、角質(zhì)形成細胞、UVB誘導小鼠致癌模型、鼠或人類皮膚等多個研究對象，受試因素也不再僅限于茶多酚、兒茶素或EGCG，咖啡堿、茶皂素、茶氨酸衍生物TBrC-L的功效也獲得了肯定。已經(jīng)取得的相關(guān)進展說明以茶葉為原料開發(fā)應用于醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的黑色素抑制劑是安全、有效、可行的。茶抑制黑色素形成的作用機制見圖1。

注：皮膚（灰色）中包含角質(zhì)形成細胞（藍色）與黑色素細胞/黑色素瘤細胞（黃色），黑色素瘤源自黑色素細胞。茶葉有效成分通過影響細胞的形態(tài)和生命活動、抑制UVB誘導的黑色素瘤產(chǎn)生、為皮膚提供光保護等方式抑制黑色素的形成

前期研究表明，兒茶素類、茶黃素類、茶皂素等多種茶葉單體成分都能抑制黑色素的形成。兒茶素中還有一些成分對酪氨酸酶活性的抑制效果優(yōu)于EGCG，如ECG[3,30-31]。GCG對酪氨酸酶活性的抑制效果也很強[30]，但在不同的試驗中，或強于EGCG[30]，或弱于EGCG[3]，因此有待進一步驗證。此外，茶黃素類（TF1、TF2A、TF2B、TF3）對酪氨酸酶的抑制作用強于EGCG[32]?？Х葔A是常規(guī)茶發(fā)揮減少癌癥發(fā)生和降低組織脂肪水平作用的關(guān)鍵成分[53]。試驗證明，常規(guī)茶對皮膚癌變的抑制效果優(yōu)于脫咖啡堿茶，單獨口服或外涂咖啡堿對UVB誘導的曬傷和癌變也有很強的抑制作用。在脫咖啡堿的茶中添加咖啡堿可恢復這些茶對UVB誘導的癌變的抑制作用；這些結(jié)果表明，咖啡堿是茶葉中對UVB誘導的完全癌變起抑制作用的重要組分[51]。

另一方面，比較不同茶類對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制率的試驗結(jié)果表明，鐵觀音（62.28%）>花茶（34.76%）>普洱茶（29.00%）>綠茶（9.50%）[23]。還有一些試驗顯示紅茶提取物和白茶提取物抑制黑色素生成的效果優(yōu)于EGCG[34]。在減少黑色素積累量和抑制樹突傳遞黑素小體方面，紅茶提取物的效果優(yōu)于綠茶和白茶，但三者均優(yōu)于曲酸和熊果苷[34]。在口服綠茶或紅茶抑制UVB光誘導的SKH-1小鼠皮膚完全癌變試驗中，綠茶抑制癌變的效果更強[51]。這些試驗結(jié)果的矛盾處有可能是試驗材料、試劑濃度等的差異造成的，需要后期更多的試驗加以驗證。

綜上可見，雖然茶葉在抑制酪氨酸酶活性、黑色素細胞的生長增殖浸潤轉(zhuǎn)移、皮膚癌發(fā)生等方面的研究取得了一定的進展，但是仍有許多方面需進一步研究。其一，咖啡堿或茶葉其他成分選擇性地促進DNA損傷組織中細胞凋亡的機理需要進一步探索；其二，茶紅素、茶褐素等兒茶素氧化聚合物及茶氨酸等其他茶葉成分在抑制黑色素形成方面的研究需要開展并進一步深入；其三，茶葉抑制黑色素細胞或黑色素瘤細胞中黑色素合成的生物學特征及分子機制需要深入，如研究哪些信號通路參與或調(diào)控了某一成分對黑色素合成的抑制作用；其四，需進一步明確黑色素其他調(diào)控機制，如促進黑色素分解及代謝，調(diào)控酪氨酸酶翻譯后的修飾，抑制角質(zhì)形成細胞對黑素小體的攝取和吞噬等。根據(jù)總結(jié)以上研究成果，可為開發(fā)安全、高效的新型天然美白添加劑及預防或治療黑色素紊亂疾病的藥物提供理論依據(jù)。

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Inhibition of Active Compounds in Tea on Melanin Formation

WANG Wei1,2, CHEN Lin1,2, WANG Weiwei1, ZHANG Jianyong1, JIANG Heyuan1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tea Plants Biology and Resources Utilization of Agriculture Ministry, Key Laboratory of Tea Processing Engineering of Zhejiang Province, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Melanin is a kind of high molecular biological pigment. The color of skin is determined by the type and accumulation of melanin as well as the redistribution and degradation of melanosome. Solar ultraviolet radiation is the most common cause of melanin formation. Although melanin can protect skin cells from UV damage, the abnormal accumulation of melanin will lead to diseases related with melanin disorders. Therefore, the development of green, safe and efficient melanin inhibitors extracted from plants has become a research hotspot in recent years. Many studies have proved that extract or monomer compounds of tea could significantly inhibit (a) the activity of tyrosinase, (b) the growth, proliferation, infiltration and metastasis of melanocytes, (c) the occurrence of skin cancer. In this paper, the research progress of tea active compounds inhibiting melanin formation in acellular tyrosinase test system, cell test system, animal model and human skin was reviewed to fully explore the key active compounds, find a safe and efficient inhibitor of melanin synthesis and provide reference for the comprehensive utilization of tea products and increasing the added value of tea industry.

tea active compounds, melanin, acellular tyrosinase test system, cell test system, animal model, human skin

S571；Q946.84+1

A

1000-369X(2021)01-007-12

2020-04-15

2020-05-25

國家自然科學基金（31670692）、國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD04008）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2020-TRICAAS）

王蔚，女，在讀博士，主要從事茶葉化學與加工方面的研究，ww1040491839@163.com。*通信作者：jianghy@tricaas.com

（責任編輯：趙鋒）