王莉云 馬榮花 白雪

自1978年Edward等報(bào)告世界首例試管嬰兒誕生以來(lái)，人類(lèi)體外受精與胚胎移植在世界各地已被廣泛應(yīng)用。隨著人類(lèi)輔助生殖技術(shù)(ART)的不斷發(fā)展及應(yīng)用范圍的不斷拓展，人們的需求也隨之增多，醫(yī)源性相關(guān)疾病也在增加。在ART中控制性超促排卵是常規(guī)技術(shù)，可在一個(gè)助孕周期獲得多個(gè)卵子，體外受精后可有多個(gè)胚胎，從而增加妊娠幾率，但同時(shí)使得卵巢過(guò)度刺激征(OHSS)、多胎妊娠等并發(fā)癥增加，因此通常每次移植胚胎數(shù)在3個(gè)以?xún)?nèi)，剩余的胚胎進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆?。世界首例玻璃化凍融人胚胎?990年移植獲得妊娠，該技術(shù)具有不需額外購(gòu)買(mǎi)儀器、用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、最大限度地降低冷凍技術(shù)對(duì)于胚胎的影響、胚胎復(fù)蘇率高等優(yōu)點(diǎn)，隨著胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的成熟和進(jìn)步，使凍融胚胎移植(FET)臨床應(yīng)用逐漸擴(kuò)展。FET周期數(shù)和比例逐年增加。繼之全胚胎冷凍策略成為一種發(fā)展趨勢(shì)，更多的中心將其作為一種首選的治療方案。等待凍融胚胎移植患者也越來(lái)越多，研究者也更關(guān)注技術(shù)本身的安全性以及患者的獲益，如何選擇最佳凍融胚胎移植時(shí)機(jī)盡量減少進(jìn)行輔助生殖技術(shù)的達(dá)活產(chǎn)時(shí)間顯得尤為重要，但相關(guān)研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。目前未見(jiàn)研究證實(shí)經(jīng)過(guò)超促排卵取卵后母體子宮內(nèi)膜環(huán)境多久才能恢復(fù)的報(bào)道。既往經(jīng)驗(yàn)為避免超排卵的不良影響，常選擇患者自然恢復(fù)排卵大約2個(gè)月后進(jìn)行FET，有些患者甚至?xí)r間更久，但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的延遲移植使患者處于長(zhǎng)時(shí)間的渴望期待中，甚至?xí)a(chǎn)生焦慮緊張情緒，從而對(duì)未來(lái)FET可能造成不良影響。本中心利用部分體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者資料進(jìn)行分析，旨在探討首次凍融胚胎移植的時(shí)機(jī)。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2017年1月至 2018年12月在青海省人民醫(yī)院生殖中心行體外受精-胚胎移植術(shù)(IVF-ET)后行全胚冷凍患者共171例。經(jīng)患者知情同意并獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施本研究。

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)常規(guī)IVF或單精子卵母細(xì)胞漿內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)后因取卵前高孕酮、取卵后發(fā)熱、卵巢過(guò)度刺激綜合征高風(fēng)險(xiǎn)或者發(fā)生其他不可預(yù)料的意外等取消新鮮移植(embryo transfer，ET)；(2)促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑長(zhǎng)方案；(3)患者年齡介于20～40歲之間；(4)胚胎凍存均采用玻璃化冷凍方法。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并多發(fā)子宮內(nèi)膜息肉、重度不典型增生、多發(fā)子宮肌瘤、重度宮腔粘連；(2)反復(fù)種植失敗(repeated IVF-ET failure，RIF)；(3)合并卵巢或其他系統(tǒng)腫瘤；(4)合并病情未控制的甲狀腺亢進(jìn)或減退；(5)除染色體多態(tài)性以外的染色體異常。

3.分組：根據(jù)患者是否首次行經(jīng)來(lái)診準(zhǔn)備FET,連續(xù)序貫治療不間斷，移植間隔最長(zhǎng)時(shí)間約69 d確定為分組時(shí)間點(diǎn)，分為兩組，連續(xù)序貫治療間隔時(shí)間≤69 d的為間隔短(≤69 d)組共80例，等待時(shí)間治療且間隔時(shí)間>69 d為間隔長(zhǎng)(>69 d)組共91例。

二、研究方法

1. 基礎(chǔ)資料：患者的年齡、BMI、不孕類(lèi)型、不孕原因、基礎(chǔ)內(nèi)分泌均來(lái)自本中心建檔記錄。BMI=體重[kg]/身高2[m2]，患者在試管周期前在本中心測(cè)量身高、體重，計(jì)算獲得BMI；不孕類(lèi)型分為原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕；不孕原因分為子宮輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥、男方因素及其他；基礎(chǔ)內(nèi)分泌指標(biāo)為患者在本中心建檔后測(cè)量的性激素5項(xiàng)(FSH、LH、E2、PRL、T)。

2.控制性超排卵(COH)方案：長(zhǎng)方案超排卵，于治療前月經(jīng)周期的黃體中期(周期第21天或排卵后7天)應(yīng)用GnRH-a 1.25 mg,在月經(jīng)的第3～5天(約降調(diào)節(jié)14 d)開(kāi)始促排卵；當(dāng)主導(dǎo)卵泡的直徑≥18 mm，當(dāng)晚8時(shí)注射HCG 5 000～10 000 IU，以誘導(dǎo)卵泡最后成熟，并在注射HCG后36～37 h行取卵術(shù)，取卵術(shù)后常規(guī)IVF或ICSI受精，受精后形成的全部可利用D3胚胎及囊胚均玻璃化冷凍保存。

3.內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：(1)自然周期方法：在月經(jīng)第8～10天B超監(jiān)測(cè)卵泡,當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)15 mm時(shí)，每天測(cè)尿LH峰,卵泡直經(jīng)大于18 mm或出現(xiàn)尿LH峰，當(dāng)日肌注HCG 5 000 IU，B超監(jiān)測(cè)排卵后第3天移植卵裂期胚胎或第5天移植囊胚。(2)降調(diào)節(jié)人工周期，用于自然周期無(wú)排卵、自然周期內(nèi)膜不佳，黃體期給予達(dá)菲林1.25 mg，降調(diào)節(jié)14 d后開(kāi)始雌孕激素準(zhǔn)備內(nèi)膜給予β17雌二醇(芬嗎通)2 mg。每日根據(jù)內(nèi)膜生長(zhǎng)情況逐漸增加劑量至6 mg/日，通常當(dāng)雌激素應(yīng)用大于10 d，內(nèi)膜厚度超過(guò)8 mm時(shí)進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化給予安琪坦膠丸0.4～0.6 g/d陰道塞入，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化3 d后移植卵裂期胚胎或者轉(zhuǎn)化5 d后移植囊胚。

4.指標(biāo)定義：卵裂率=(授精卵裂胚胎數(shù)/受精卵數(shù))×100%，優(yōu)胚率=(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù))×100%，ET優(yōu)胚率=(移植的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/移植的胚胎數(shù))×100%，獲胚數(shù)指獲得的可利用的胚胎數(shù)，ET胚胎數(shù)指移植的胚胎數(shù)量。

結(jié) 果

一、兩組患者一般情況比較

兩組患者年齡、BMI、不孕類(lèi)型、不孕原因、基礎(chǔ)內(nèi)分泌差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

二、兩組患者不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案比較

兩組患者采用降調(diào)節(jié)人工周期及自然周期行內(nèi)膜準(zhǔn)備，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組一般情況分析(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 1 Basic characteristics between the two groups

表2 兩組不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的比較[例(%)]Table 2 Comparison of different endometrial preparation schemes between the two groups [n(%)]

三、兩組患者移植囊胚和卵裂期胚胎情況比較

兩組患者移植囊胚和卵裂期胚胎所占比例相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組囊胚和卵裂期移植情況比較[例(%)]Table 3 Comparison of blastocyst and cleavage transplantation between the two groups [n(%)]

依據(jù)獲卵數(shù)多少再進(jìn)行分組，獲卵數(shù)>15個(gè)組有90例，獲卵數(shù)≤15個(gè)組有81例，兩組妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但獲卵數(shù)>15個(gè)組的妊娠率有增高趨勢(shì)，見(jiàn)表4。

四、兩組患者妊娠結(jié)局的比較

間隔短(≤69 d)組患者在HCG日E2值低于間隔長(zhǎng)(>69 d)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。間隔短(≤69 d)組患者卵裂率、優(yōu)胚率、ET優(yōu)胚率及臨床妊娠率均高于間隔長(zhǎng)(>69 d)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者在HCG日的LH值、P值、獲卵數(shù)、受精率、獲胚數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表4 根據(jù)獲卵數(shù)分組[例(%)]Table 4 Pregnancy rate according to the number of ovums [n(%)]

表5 兩組妊娠結(jié)局比較(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 5 Comparison of pregnancy outcomes

討 論

本研究結(jié)果顯示間隔短(≤69 d)組妊娠率略高于間隔長(zhǎng)(>69 d)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與間隔短(≤69 d)組患者移植優(yōu)質(zhì)胚胎比例和數(shù)量相對(duì)高有關(guān)，使其臨床妊娠率有增高趨勢(shì)，但是否與間隔短(≤69 d)組患者移植時(shí)間間隔較短，患者心理狀態(tài)及依從性好有關(guān)系，還需大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。2018年Ozgur[1]等對(duì)1 121例全胚凍存后行FET患者進(jìn)行不同移植時(shí)間間隔研究報(bào)道，756例32～46 d 行FET，226例47～61 d行FET，139例大于62 d行FET，結(jié)果顯示1次月經(jīng)后FET的活產(chǎn)率為57.8%與4次月經(jīng)后FET的活產(chǎn)率(54.9%)相似。2018年梁利東[2]等研究報(bào)道全胚凍存后79例≤45 d為鄰近組，276例>45 d為非臨近組，兩組臨床妊娠率分別為51.9%和48.2%，活產(chǎn)率分別為43%和38.4%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為取消IVF新鮮周期移植后的第一個(gè)周期中立即行FET的臨床妊娠率和活產(chǎn)率與至少經(jīng)歷一次月經(jīng)周期后的FET無(wú)明顯差異。通過(guò)本研究及以上相關(guān)報(bào)道，可以認(rèn)為全胚胎凍存后，首次行經(jīng)即可開(kāi)始行凍融胚胎移植準(zhǔn)備，不影響成功率且這種連續(xù)序貫治療，可使患者心理適應(yīng)性好從而可以減少焦慮緊張情緒相關(guān)。

本研究納入的患者均采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑長(zhǎng)方案進(jìn)行控制性超促排卵，因此方案可抑制內(nèi)源性峰提早出現(xiàn)，從而改善卵子質(zhì)量，提高排卵率和優(yōu)質(zhì)胚胎率，開(kāi)啟了IVF-ET 的里程碑，但即使如此優(yōu)化的方案仍擺脫不了妊娠率低的難題，其中子宮內(nèi)膜容受性及胚胎-子宮對(duì)話異常被認(rèn)為是引發(fā)胚胎著床失敗、導(dǎo)致妊娠率低的關(guān)鍵因素[3]。吳瓊等研究發(fā)現(xiàn)，GnRHa 超排卵后，多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育成熟排出，引起小鼠著床期雌、孕激素失衡，子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，不能為胚胎著床提供良好的微環(huán)境,并可能通過(guò)下調(diào) LIF、p-STAT3、HBEGF 和 glycodelin A 蛋白的表達(dá)影響子宮內(nèi)膜容受性的建立和胚胎-子宮對(duì)話，進(jìn)而對(duì)胚胎著床產(chǎn)生一定的不利影響，導(dǎo)致胚泡發(fā)育緩慢，著床數(shù)量減少[4]。本結(jié)果顯示兩組患者獲卵數(shù)均較多，間隔短(≤69 d)組獲卵數(shù)約17枚，間隔長(zhǎng)(>69 d)組約15枚，HCG日E2值顯著增高，超排卵期間及取卵術(shù)后除外易導(dǎo)致OHSS發(fā)生，雌孕激素失衡明顯，不利于胚胎著床，因此選擇全胚冷凍后擇期FET移植在一定程度上是合理的。另外，研究證明，超排卵可導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育或者隨后的胚胎植入過(guò)程中患者血中雌二醇、孕酮、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等在內(nèi)的多種激素水平明顯增加[5]，超過(guò)正常的生理水平。因此，異常的激素環(huán)境對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能、子宮內(nèi)膜容受性、胚胎的植入等產(chǎn)生了什么樣的負(fù)面影響？超排卵后激素水平及子宮內(nèi)膜多久才可以恢復(fù)到正常生理狀態(tài)呢？研究表明，超排卵期間卵巢中存在多個(gè)卵泡，每個(gè)卵泡均分泌雌二醇(E2)進(jìn)入循環(huán)，使循環(huán)中E2水平顯著升高，可高達(dá)1 500～5 000 pg/mL，卵巢高反應(yīng)的患者E2水平甚至更高，而高劑量的E2會(huì)影響子宮內(nèi)膜。在一項(xiàng)體外研究中發(fā)現(xiàn)，將小鼠胚胎與從人類(lèi)可生育的婦女獲得的子宮內(nèi)膜組織一起培養(yǎng)，將胚胎暴露在高濃度E2環(huán)境下，其胚胎發(fā)育異常，粘附力下降[6]。其次，超排卵導(dǎo)致孕激素的提前升高使子宮內(nèi)膜接受窗發(fā)生改變，而這一環(huán)境的改變可引起胚胎的表觀遺傳學(xué)改變，其效應(yīng)可能影響子代生長(zhǎng)受限，且這種變化會(huì)貫穿于后代整個(gè)生命周期[7]。然而子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎著床率的重要影響因素，研究表明超排卵可使子宮內(nèi)膜從組織學(xué)上發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜腺體的上皮細(xì)胞管腔表面出現(xiàn)胞飲小泡[8]，超排卵期間這種改變會(huì)出現(xiàn)的比自然狀態(tài)下更早。IVF周期取卵當(dāng)天的子宮內(nèi)膜活檢發(fā)現(xiàn)，獲卵數(shù)更多、更年輕的患者子宮內(nèi)膜的組織學(xué)改變會(huì)更早發(fā)生[9]，這一系列的改變可降低子宮內(nèi)膜與“種植窗期”有關(guān)的特殊整合素的表達(dá)，影響其接受胚胎的最佳時(shí)機(jī)[10]，從而降低胚胚胎著床率及妊娠率。本研究中所納入的均為年輕患者，獲卵數(shù)多，間隔短(≤69 d)組患者E2值為(5 660.7±2 650.4)，間隔長(zhǎng)(>69 d)組E2值為(5 958.9±3 944.1)，E2值間隔短(≤69 d)組明顯高于間隔長(zhǎng)(>69 d)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；間隔短(≤69 d)組臨床妊娠率為68.7%(55/80)，間隔長(zhǎng)(>69 d)組臨床妊娠率為52.7%(48/91)，間隔短(≤69 d)組臨床妊娠率明顯高于間隔長(zhǎng)(>69 d)組，表明全胚凍存后首次來(lái)月經(jīng)后子宮內(nèi)膜容受性基本恢復(fù)。2017年Lattes[11]等對(duì)512周期凍胚移植周期的妊娠結(jié)局做了對(duì)比，其中263例取卵后歷經(jīng)一個(gè)月經(jīng)周期后行移植術(shù)，249例取卵后歷經(jīng)2個(gè)月經(jīng)周期后移植，兩組相比，1個(gè)月經(jīng)周期后活產(chǎn)率(37.6%)高于2個(gè)月經(jīng)周期后的活產(chǎn)率(27.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且多因素回歸分析表明對(duì)活產(chǎn)率有顯著影響的變量是母親的年齡、移植胚胎的數(shù)量、移植時(shí)胚胎發(fā)育的天數(shù)和內(nèi)膜準(zhǔn)備類(lèi)型，而與移植的時(shí)間間隔沒(méi)有關(guān)系。

是否全胚胎凍存時(shí)代已經(jīng)到來(lái)？當(dāng)今國(guó)內(nèi)外眾多研究充分證明FET各種優(yōu)勢(shì)所在，似乎胚胎“凍一凍”會(huì)更好。甚至有科學(xué)家提出了“非選擇性全胚胎冷凍移植(freeze-all ET)”的概念。從2013年到2015年美國(guó)輔助生殖技術(shù)年報(bào)顯示新鮮周期移植率從86.7%到73.6%下降[12]，同期，中國(guó)中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)(CSRM)輔助生殖技術(shù)數(shù)據(jù)上報(bào)系統(tǒng)中顯示新鮮周期移植率從67.7%下降到53.1%，2016年繼續(xù)下降為47.8%[13]。

為什么胚胎“凍一凍”會(huì)更好？首先從母體方面看，新鮮胚胎移植時(shí)超排卵周期母體處在高雌激素水平環(huán)境及促排卵藥物使用超出正常生理范疇，對(duì)子宮產(chǎn)生不利影響，冷凍胚胎保存后，待母體恢復(fù)到自然的狀態(tài)再解凍移植，可以避免新鮮周期母體超生理水平狀態(tài)移植產(chǎn)生的不利影響。在妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、圍產(chǎn)期出血等妊娠并發(fā)癥方面，F(xiàn)ET是否較新鮮胚胎移植增加上述風(fēng)險(xiǎn)目前各種研究結(jié)果不一、尚無(wú)定論，有研究認(rèn)為FET妊娠期高血壓增高[14]、胎盤(pán)粘連發(fā)病率高[15]、產(chǎn)后出血的發(fā)生率高[16]、也有研究認(rèn)為子癇、妊娠期糖尿病、產(chǎn)后出血并無(wú)差異[17-18]，各研究不一致可能與研究人群、研究方案不同有關(guān)。

從胚胎方面看，冷凍保存的胚胎經(jīng)過(guò)了冷凍、解凍過(guò)程，可以“優(yōu)勝劣汰”，此時(shí)仍然存活并正常發(fā)育的胚胎也許是更適應(yīng)外界環(huán)境，更具有生存潛能的健康寶寶。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者研究報(bào)道全胚胎玻璃化冷凍復(fù)蘇移植患者分娩孕周、早產(chǎn)、出生胎兒體重等各項(xiàng)指標(biāo)均與新鮮周期移植無(wú)差異[19-21]。王桂泉綜述了近年來(lái)FET與鮮胚移植的相關(guān)研究，報(bào)道FET組低出生體重、小于胎齡兒、早早產(chǎn) 、早產(chǎn)的發(fā)生率明顯低于新鮮胚胎組，而大于胎齡兒、巨大兒、過(guò)期妊娠、圍生期死亡的發(fā)生率高于新鮮胚胎組。新生兒先天畸形發(fā)生率、重癥監(jiān)護(hù)室入院率無(wú)顯著差異。研究認(rèn)為這可能與新鮮胚胎移植時(shí)母體的高雌激素水平，而FET后胚胎的表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)[22]。

本中心數(shù)據(jù)依據(jù)獲卵數(shù)再進(jìn)行組，統(tǒng)計(jì)顯示獲卵數(shù)>15個(gè)組和獲卵數(shù)≤15個(gè)組妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但獲卵數(shù)>15個(gè)組妊娠率有增高趨勢(shì)，提示在長(zhǎng)方案促排卵獲卵數(shù)多的患者行全胚胎凍存可能可以減輕早發(fā)OHSS病情，避免晚發(fā)OHSS風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于非長(zhǎng)方案促排卵及卵巢低反應(yīng)患者，國(guó)外有學(xué)者回顧性研究顯示，在應(yīng)用微刺激促排卵時(shí)，F(xiàn)ET組與新鮮胚胎移植組各項(xiàng)臨床結(jié)局指標(biāo)均無(wú)顯著差異，卵巢低反應(yīng)全胚胎凍存似乎并無(wú)明顯獲益[23]。這有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示長(zhǎng)方案促排卵高反應(yīng)和正常反應(yīng)患者全胚胎凍存后首次行經(jīng)即可開(kāi)始凍融移植準(zhǔn)備，連續(xù)序貫治療縮短移植時(shí)間，并不降低妊娠率且可縮短患者TTLB，使患者更加獲益。但非長(zhǎng)方案促排卵及卵巢低反應(yīng)患者結(jié)局是否一致有待進(jìn)一步研究。因此，是否全胚胎凍存需根據(jù)患者的促排卵方案及卵巢反應(yīng)性，在患者充分知情同意后選擇個(gè)體化的移植策略。