蘆凱，張帥，周石，程芝梅，徐圣杰，蔣天鵬△，李興

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，居全世界癌癥相關(guān)死亡的第4位［1］。目前根治性切除術(shù)是早期HCC患者的主要治療方式［2］。經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transarterial catheter chemoembolization，TACE）指經(jīng)股動(dòng)脈穿刺送入導(dǎo)絲導(dǎo)管，在數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）機(jī)下超選擇性插管至HCC的供血?jiǎng)用}后，經(jīng)導(dǎo)管注入適量化療藥物和栓塞顆粒，從而誘導(dǎo)HCC缺血壞死及凋亡，是不能切除的中晚期HCC最主要的治療方法［3］。然而，TACE術(shù)后患者的遠(yuǎn)期預(yù)后并不理想，這可能與不完全栓塞所致腫瘤不完全壞死有直接關(guān)系［4］，但其具體機(jī)制尚未明確。Notch信號(hào)通路在肝臟發(fā)育［5］和肝癌進(jìn)展［6-7］中的作用已被廣泛認(rèn)識(shí)，而肝癌中Notch信號(hào)通路與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）密切相關(guān)［8］。TACE導(dǎo)致HCC局部缺氧和缺血性壞死，使缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）活化和VEGF水平升高［3］。目前已有研究指出Notch信號(hào)通路參與超聲不完全消融后殘余肝癌的血管新生［8］，TACE與超聲消融同屬HCC的介入治療方式之一，均可引起HCC的不完全壞死［4,8］，但TACE不完全栓塞對(duì)Notch2以及相關(guān)因子表達(dá)水平影響的相關(guān)研究較少。本研究通過建立兔VX2肝癌TACE不完全栓塞模型，檢測(cè)TACE不完全栓塞前后腫瘤體積的變化及Notch2、HIF-1α、VEGF的蛋白水平，以探究TACE不完全栓塞對(duì)HCC的影響，為臨床治療HCC提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級(jí)新西蘭大白兔18只［動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001］，均1月齡、體質(zhì)量2 kg左右、雌雄各半，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；兔VX2肝癌細(xì)胞株購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司；鼠源β-actin單克隆抗體、兔源Notch2單克隆抗體、鼠源HIF-1α單克隆抗體、鼠源VEGF單克隆抗體、羊抗兔及羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自Abcam公司；鹽酸吡柔比星購(gòu)自杭州翰暉制藥有限公司；罌粟乙碘油注射液購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。超聲設(shè)備（PHILIPS IU22）；CT設(shè)備（SIEMENS Somatom DefinitionAS）；DSA機(jī)（TOSHIBA INFX-9000C）；光 學(xué) 顯 微 鏡（Nikon SMZ800N）；蛋白電泳儀（Bio-Rad，Powerza）。

1.2 兔VX2肝癌模型建立根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法抽取2只大白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，雙側(cè)后腿外側(cè)分別備皮、消毒、局麻，超聲引導(dǎo)下5 F套管針穿刺進(jìn)入后腿肌肉深部，退出針芯，經(jīng)管鞘推入VX2細(xì)胞株，插入針芯后拔針，壓迫止血并消毒包扎，常規(guī)喂養(yǎng)2周，待后腿腫瘤形成后建成荷瘤兔。實(shí)驗(yàn)兔（n=16）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。操作前8 h禁食，4 h禁水。將VX2荷瘤兔用3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）于耳緣靜脈緩慢推注生效后，于后腿腫瘤體表投影區(qū)作縱行切口，暴露后腿腫瘤，于無菌條件下鈍性取出腫瘤放于冰上培養(yǎng)皿，去除腫瘤周圍肌肉、筋膜等組織后，剪取灰白魚肉樣腫瘤組織成1 mm3的小瘤塊備用。實(shí)驗(yàn)兔麻醉方法同前，將實(shí)驗(yàn)兔用繃帶固定于操作臺(tái)，劍突下正中偏左1 cm區(qū)域備皮、消毒，用一次性手術(shù)刀逐層切開，暴露肝左葉于體外鹽水紗布上，以5 F套管針鞘斜行刺入肝左葉深約1 cm，將備用小瘤塊裝滿鞘管，在針芯配合下將小瘤塊全部推送至肝臟內(nèi)，用明膠海綿封堵穿刺道并壓迫2 min，確認(rèn)無出血及瘤塊溢出后將肝左葉回納入腹腔，逐層縫合切口，碘伏消毒、包扎。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素40萬U/d預(yù)防感染。將所有實(shí)驗(yàn)兔采用隨機(jī)數(shù)表法分為實(shí)驗(yàn)組（n=8）和對(duì)照組（n=8）。

1.3 超聲篩查并監(jiān)測(cè)腫瘤體積分別于瘤塊植入后7、14、21 d行上腹部超聲檢測(cè)腫瘤是否生成并測(cè)量腫瘤體積，根據(jù)公式V=（1/2）×a×b2計(jì)算腫瘤體積（a為腫瘤最大徑；b為腫瘤最小徑）。

1.4 建立兔VX2肝癌TACE不完全栓塞模型瘤塊植入后14 d行TACE不完全栓塞術(shù)。常規(guī)麻醉生效后，將所有實(shí)驗(yàn)兔用繃帶固定于DSA檢查床，右股動(dòng)脈區(qū)備皮、消毒、鋪敷，2%利多卡因5 mL局麻，沿股動(dòng)脈走行縱行切開皮膚，暴露并鈍性分離股動(dòng)脈鞘，下穿4號(hào)線提緊遠(yuǎn)心端以使股動(dòng)脈充盈，用20 G套管針穿刺成功后，下穿4號(hào)線將股動(dòng)脈和20 G套管針固定后，退出針芯，引入EV3神經(jīng)微導(dǎo)管、微導(dǎo)絲，透視下在T12～L1椎體水平依次找到腹腔動(dòng)脈、肝總動(dòng)脈、肝固有動(dòng)脈及肝左動(dòng)脈并超選至肝左動(dòng)脈，手推造影確認(rèn)后退出導(dǎo)絲回抽排空導(dǎo)管內(nèi)氣體，接高壓注射器減影，造影劑總量5 mL，注射流率1 mL/s。確定腫瘤由肝左動(dòng)脈供血后，實(shí)驗(yàn)組兔以10 mg吡柔比星加入5 mL造影劑混合成水溶液，再以水溶液∶碘油=8∶1配成碘油乳劑，透視下緩慢注入0.5 mL，待有反流至肝固有動(dòng)脈及肝右動(dòng)脈趨勢(shì)時(shí)停止，注畢用0.5 mL生理鹽水沖洗導(dǎo)管，再次高壓減影見肝左動(dòng)脈直徑變窄，血流緩慢后結(jié)束手術(shù)。對(duì)照組兔經(jīng)肝左動(dòng)脈注入生理鹽水1 mL。術(shù)畢拔管，結(jié)扎右側(cè)股動(dòng)脈，碘伏消毒股動(dòng)脈鞘區(qū)，逐層縫合切口后再次消毒切口皮膚。術(shù)后肌注青霉素40萬U/d，連用3 d預(yù)防感染。本研究將TACE不完全栓塞定義為：（1）術(shù)中DSA減影滿足栓塞后肝左動(dòng)脈仍可見造影劑通過，腫瘤染色加深。（2）術(shù)后CT可見瘤灶內(nèi)碘油沉積不良的低密度區(qū)，增強(qiáng)呈輕度強(qiáng)化。（3）術(shù)后肝癌組織HE染色鏡下除可見大量壞死細(xì)胞及癌細(xì)胞殘影外，仍可見少量異常分化癌細(xì)胞［4,9］。

1.5 CT平掃+增強(qiáng)檢查腫瘤形態(tài)及壞死程度分別于TACE不完全栓塞術(shù)前及術(shù)后7 d行CT平掃+增強(qiáng)檢查。檢查前8 h禁食，4 h禁飲，常規(guī)麻醉生效后，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兔置于CT檢查床上，腹帶加壓控制呼吸幅度，耳緣靜脈建立通道，連接高壓注射器，對(duì)比劑總量為10 mL（6 mL碘佛醇+4 mL生理鹽水），注射速率1 mL/s。應(yīng)用追蹤系統(tǒng)監(jiān)測(cè)膈水平主動(dòng)脈，當(dāng)對(duì)比劑密度達(dá)到峰值時(shí)掃描動(dòng)脈期，間隔16 s后掃描門脈期。掃描所需管電壓、管電流、掃描視野（field of view，F(xiàn)OV）分別為120 kV、250 mA、200 mm，掃描層厚2.5 mm。所有圖像均以1 mm層厚重建。確診HCC的CT標(biāo)準(zhǔn)為：平掃肝左葉見圓形、類圓形或不規(guī)則形低密度腫塊影，邊界不清（有假包膜者較清晰），增強(qiáng)掃描動(dòng)脈期明顯均勻或不均勻強(qiáng)化（腫瘤內(nèi)壞死區(qū)不強(qiáng)化），門脈期強(qiáng)化程度迅速下降，延遲期強(qiáng)化程度持續(xù)下降呈相對(duì)低密度表現(xiàn)，全部增強(qiáng)過程表現(xiàn)為“快進(jìn)快出”。

1.6 HE染色觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)瘤塊植入后21 d處死所有實(shí)驗(yàn)兔，暴露肝臟方法同前，鈍性剝離并取出肝臟腫瘤，去除腫瘤周圍正常肝臟及筋膜等組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，每只兔的肝癌組織選取最大切面做3張HE染色切片，400倍光鏡觀察并采集圖像。

1.7 Western blot檢測(cè)肝癌組織Notch2、HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)水平取所有實(shí)驗(yàn)組兔和對(duì)照組兔肝癌組織各100 mg，加入1 mL裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）置于冰上研磨30 min，然后12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度。用10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，鼠抗β-actin（1∶2 000）、兔抗Notch2（1∶500）、鼠抗HIF-1α（1∶500）及鼠抗VEGF（1∶500）于4℃孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG（1∶10 000）二抗室溫孵育2 h?，F(xiàn)配ECL發(fā)光液浸泡條帶，隨后凝膠成像系統(tǒng)收集圖像，Image J軟件分析比較條帶灰度值并計(jì)算表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤超聲篩查及體積監(jiān)測(cè)情況16只實(shí)驗(yàn)兔均成功建立VX2肝癌模型（圖1）；實(shí)驗(yàn)組DSA下均成功建立VX2肝癌不完全栓塞模型。瘤塊植入后7 d（TACE不完全栓塞術(shù)前7 d）、14 d（即TACE不完全栓塞術(shù)當(dāng)天）和21 d（即TACE不完全栓塞術(shù)7 d）腫瘤體積分別為實(shí)驗(yàn)組（0.40±0.33）、（1.30±0.90）、（2.42±0.97）cm3；對(duì)照組（0.34±0.35）、（1.76±0.69）、（6.79±4.76）cm3，瘤塊植入后21 d實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（n=8，t=2.543，P＜0.05），7 d、14 d時(shí)2組腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為0.348、1.147，均P＞0.05）。

Fig.1 Ultrasound screening and volume monitoring of tumor圖1 腫瘤超聲篩查及體積監(jiān)測(cè)情況

2.2 兔VX2肝癌TACE不完全栓塞模型的建立DSA下減影示腫瘤均由肝左動(dòng)脈供血，未見其他變異及隱匿供血?jiǎng)用}。注入造影劑后，腫瘤大部分呈結(jié)節(jié)狀染色，部分腫瘤呈先邊緣環(huán)形染色，后逐漸向中央填充，肝左動(dòng)脈末段及其分支增多、紊亂，包繞腫瘤，呈“抱球征”。經(jīng)肝左動(dòng)脈注入吡柔比星和碘油混合乳劑后見碘油乳劑逐漸沉積于瘤灶內(nèi)，栓塞后減影見肝左動(dòng)脈仍有造影劑緩慢通過，腫瘤染色加深，見圖2。

Fig.2 DSA subtraction of left hepatic artery after TACE incomplete embolization圖2 TACE不完全栓塞后DSA肝左動(dòng)脈減影情況

2.3 腫瘤形態(tài)及壞死程度CT表現(xiàn)TACE不完全栓塞術(shù)前CT平掃示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兔肝左葉均可見一類圓形低密度腫塊影，邊界欠清，部分呈分葉狀，見圖3A、B。增強(qiáng)動(dòng)脈期腫塊呈明顯均勻/不均勻強(qiáng)化，與周圍肝實(shí)質(zhì)分界清晰。門脈期和延遲期，造影劑逐漸退出，腫塊強(qiáng)化程度逐漸下降呈相對(duì)低密度。術(shù)后7 d再次行CT平掃+增強(qiáng)檢查顯示：實(shí)驗(yàn)組腫瘤內(nèi)弧形及斑片狀高密度碘油沉積，表示腫瘤已壞死，另見碘油沉積不良的低密度區(qū)，系腫瘤未壞死實(shí)性部分，見圖3C、D，增強(qiáng)動(dòng)脈期呈輕度強(qiáng)化，代表殘存腫瘤；對(duì)照組除腫瘤體積增大外，余較術(shù)前變化不大。

Fig.3 CT findings of tumor morphology and degree of necrosis before and after TACE incomplete embolization圖3 TACE不完全栓塞前后腫瘤形態(tài)及壞死程度CT所見

2.4 2組肝癌組織HE染色情況對(duì)照組肝癌組織由大量肝癌細(xì)胞及血竇狀間隔構(gòu)成，由于血管的分隔較少，腫瘤細(xì)胞大部分呈片狀分布，少部分呈巢狀分布，瘤巢間無明顯纖維間質(zhì)。腫瘤細(xì)胞核深染且不規(guī)則，異型性明顯，見圖4A；實(shí)驗(yàn)組肝癌組織中心可見大片壞死細(xì)胞及少量肝癌細(xì)胞殘影，周邊可見少量殘存肝癌細(xì)胞，核深染，異型性明顯，見圖4B。

Fig.4 HE staining of tumor tissues in two groups(×400)圖4 2組肝癌組織HE染色（×400）

2.5 TACE不完全栓塞對(duì)肝癌組織HIF-1α、Notch2及VEGF蛋白表達(dá)水平的影響實(shí)驗(yàn)組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），2組間Notch2與VEGF蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5、表1。

Fig.5 Expression levels of HIF-1α,Notch2 and VEGF proteins of hepatocellular carcinoma tissues in two groups圖5 2組肝癌組織HIF-1α、Notch2及VEGF蛋白表達(dá)水平

Tab.1 Expression levels of HIF-1α,Notch2 and VEGF proteins of hepatocellular carcinoma tissues in two groups表1 2組腫瘤HIF-1α、Notch2及VEGF蛋白表達(dá)水平

3 討論

目前，原發(fā)性肝癌發(fā)病率居我國(guó)惡性腫瘤第4位及癌癥相關(guān)致死原因第2位，嚴(yán)重危害我國(guó)公民的生命健康［10］。大多數(shù)HCC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，手術(shù)切除已無法獲得良好預(yù)后，而TACE通過使用碘化油作為攜帶化療藥物的載體，使兩者形成碘油乳劑沉積于HCC瘤灶內(nèi)，持續(xù)發(fā)揮化療藥物對(duì)HCC的細(xì)胞毒性作用，再通過使用栓塞顆粒阻塞HCC的供血?jiǎng)用}而阻斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給，既可減輕全身化療不良反應(yīng)，又可達(dá)到“殺死”及“餓死”HCC的目的，相比保守及支持治療，TACE治療具有更明顯的生存優(yōu)勢(shì)且安全性高［11］，已成為中晚期HCC局部治療最常用的方法［12］。TACE術(shù)后有殘瘤的情況難以避免，如TACE術(shù)后腫瘤不完全壞死，這可能與HCC的肝動(dòng)脈、門靜脈雙重供血，血管再通，栓塞后大量側(cè)支循環(huán)形成以及TACE不完全栓塞有關(guān)［4］。但是，TACE不完全栓塞對(duì)HCC的影響目前卻鮮有報(bào)道。根據(jù)改良實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［9］和盧維［4］的研究，本研究建立了兔VX2肝癌TACE不完全栓塞模型，除CT及HE染色結(jié)果以外，本研究增加DSA減影，用3種檢查結(jié)合的方式證明兔VX2肝癌TACE不完全栓塞模型建立成功。

有研究表明TACE可造成HCC局部缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)下游靶基因VEGF，加速HCC血管新生［13］，這可能進(jìn)一步使殘存腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致長(zhǎng)期療效不佳。Hayashi等［14］研究發(fā)現(xiàn)，Notch2通過對(duì)其下游靶基因Split多毛增強(qiáng)子1（HES1）的正向調(diào)控及上皮型鈣黏蛋白（Ecadherin）的負(fù)向調(diào)控，促進(jìn)HCC細(xì)胞向不成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并增強(qiáng)HCC的侵襲及遷移能力，提示Notch2與HCC的發(fā)生密不可分。且HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路參與超聲不完全消融后HCC殘瘤的進(jìn)展［8］。臨床上常使用TACE與超聲消融聯(lián)合的方式治療HCC，但Notch2通路及相關(guān)因子在TACE不完全栓塞所致HCC殘瘤中的表達(dá)情況尚不明確。本研究中實(shí)驗(yàn)組TACE不完全栓塞術(shù)后7 d肝腫瘤體積明顯小于同期對(duì)照組，與Song等［15］使用常規(guī)TACE研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)組肝癌組織HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，與陳錦隆等［16］使用常規(guī)TACE研究結(jié)果一致，提示TACE不完全栓塞對(duì)HCC生長(zhǎng)有抑制作用，并且可以形成缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組TACE不完全栓塞后HCC的Notch2及VEGF蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合既往研究分析，考慮出現(xiàn)種結(jié)果的原因可能有3個(gè)：（1）檢測(cè)的HCC組織TACE不完全栓塞術(shù)后碘油沉積不均勻，導(dǎo)致不同腫瘤、同一腫瘤內(nèi)不同區(qū)域的細(xì)胞活性不一，從而影響HCC細(xì)胞蛋白的表達(dá)［17-18］。（2）本實(shí)驗(yàn)選擇的碘油乳劑比例為水溶液∶碘油=8∶1，碘油占比過低造成的不完全栓塞，或術(shù)后短時(shí)間血管再通導(dǎo)致腫瘤血供豐富。（3）腫瘤存在難以被發(fā)現(xiàn)的隱匿供血?jiǎng)用}。鄧博文等［19］研究發(fā)現(xiàn)，HCC除由正常肝動(dòng)脈供血外，其他肝外動(dòng)脈也可能參與供血，如腎上腺動(dòng)脈等。TACE不完全栓塞后腫瘤仍可獲得較多血流及養(yǎng)分，可能導(dǎo)致腫瘤不會(huì)主動(dòng)激發(fā)新生血管來獲得營(yíng)養(yǎng)，因此可能不會(huì)刺激VEGF及相關(guān)蛋白Notch2升高。

根據(jù)原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019版），TACE的適應(yīng)證已由中國(guó)肝癌分期為Ⅰb期～Ⅲa期擴(kuò)大至Ⅰb期～Ⅲb期患者，但肝功能Child-Pugh分級(jí)為C級(jí)的HCC患者已屬Ⅳ期，目前除了對(duì)癥支持、舒緩療護(hù)以及肝移植外，尚無其他較好的治療方式。Child C級(jí)HCC患者一般情況差，肝功能嚴(yán)重障礙，而TACE在阻斷HCC供血?jiǎng)用}的同時(shí)也阻斷了一部分正常肝細(xì)胞的血液營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，這可能導(dǎo)致諸如肝功能衰竭等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，危及患者生命，因此TACE目前無法應(yīng)用于Child C級(jí)HCC患者［20］。本研究結(jié)果顯示，TACE不完全栓塞對(duì)HCC的生長(zhǎng)有一定抑制作用。與常規(guī)TACE相比，TACE不完全栓塞后的正常肝組織能獲得較多的血液及營(yíng)養(yǎng)供給。因此，筆者推測(cè)針對(duì)一般情況差、無合適的健康肝源進(jìn)行肝移植，但仍有非保守治療意愿的肝功能Child C級(jí)HCC患者，可以采用TACE不完全栓塞的方式進(jìn)行治療，可能在肝功能損傷較小的情況下延緩腫瘤的進(jìn)展，降低TACE術(shù)后肝衰竭的發(fā)生率，延長(zhǎng)患者的生存期。Notch2是促進(jìn)HCC生長(zhǎng)及遷移的重要因子［6］。本研究的局限性在于僅探討了TACE不完全栓塞前后HCC中Notch2蛋白表達(dá)水平的變化情況，并未行TACE完全栓塞作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，因此TACE栓塞程度對(duì)HCC中Notch2蛋白表達(dá)水平的影響尚不能定論。在今后的實(shí)驗(yàn)中在向HCC供血?jiǎng)用}注射碘油乳劑時(shí)，需采用更合適的比例，并加用明膠海綿或空白微球栓塞，同時(shí)增加TACE完全栓塞組進(jìn)行對(duì)照，使研究更加完善。

綜上所述，TACE不完全栓塞對(duì)兔VX2肝癌生長(zhǎng)有抑制作用，并且可以形成腫瘤缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)，為目前有非保守治療意愿的肝功能Child C級(jí)HCC患者的治療提供了新思路。