金燕，王靜，龐淼，張曉雪，劉開揚

宮頸癌是許多發(fā)展中國家的女性患癌死亡的常見原因，也是全球女性中最常見的惡性腫瘤［1］。溶瘤病毒（oncology virus，OVs）療法是一種相對安全有效的治療方法，可以在惡性腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制而不損害正常細(xì)胞［2］。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）則是天然溶瘤病毒的成員之一，屬于Avulavirus屬，副黏病毒科，可以用于癌癥的治療［3］。細(xì)胞骨架是維持真核細(xì)胞基本形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，可承受細(xì)胞外界壓力以及保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性［4］。NDV在腫瘤細(xì)胞中識別、感染、釋放等過程均會對細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)造成損傷［5］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架重塑可導(dǎo)致微絲及中間絲迅速解聚，使微管結(jié)構(gòu)重組，形成凋亡微管網(wǎng)，凋亡微管網(wǎng)與微絲共同包裹細(xì)胞器進(jìn)而形成凋亡小體［6-7］。NDV是否以細(xì)胞微絲骨架為靶點，通過各種途徑影響細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲尚不明確。為此，本實驗用NDV F3株感染宮頸癌HeLa細(xì)胞，探究NDV抗腫瘤與細(xì)胞微絲骨架的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料宮頸癌HeLa細(xì)胞及NDV F3株由生命科學(xué)中心P2實驗室保存。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶及細(xì)胞松弛素D（Cytochalasin D）購自美國Gibco公司；胎牛血清購自上海ExCellBio公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Matrigel膠購自美國BD公司；GAPDH抗體購自武漢ABclonal公司；RhoA、Rho激酶（ROCK）2、F-肌動蛋白（F-actin）抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京博奧森公司；Transwell3422購自美國康寧公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒和Hoechst33258購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)-R250購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的MEM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和溫度條件下常規(guī)培養(yǎng)。NDV F3原液感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100，用DMEM無血清培養(yǎng)基稀釋NDV F3，MOI分別為10、1、0.1、0.01、0.001。用NDV F3（終濃度MOI=0.1）分別作用細(xì)胞12、24和36 h，然后普通倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.2 HeLa細(xì)胞微絲骨架染色考馬斯亮藍(lán)染色用于骨架形態(tài)及完整性研究，TritonX-100可以溶解脂膜大部分非骨架蛋白，細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白不被溶解，考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，即可顯示骨架結(jié)構(gòu)。選取生長狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞，消化為細(xì)胞懸液，接種于6孔板中爬片，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合至30%。每孔加1%Tritonx-100并沒過玻片，37℃靜置18 min，用M緩沖液洗3次，每次3 min；用戊二醛固定20 min，PBS洗3次；考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色30 min，PBS洗3次。設(shè)置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用24 h；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D作用24 h。以上實驗均重復(fù)3次，倒置顯微鏡下觀察NDV F3感染細(xì)胞后的形態(tài)變化及微絲骨架結(jié)構(gòu)變化并攝片。

1.2.3 CCK-8法檢測HeLa細(xì)胞的增殖情況選取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化為細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合至70%～80%。細(xì)胞培養(yǎng)至12、24、36、48、60和72 h后每孔各加入10μL CCK-8，CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定各孔光密度（OD）值。設(shè)置對照組；病毒組MOI分別為1、0.1、0.01、0.01、0.001的NDV F3。增殖率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.4 Hoechst33258染色檢測HeLa細(xì)胞凋亡情況選取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰酶消化為細(xì)胞懸液，接種于6孔板中爬片，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合至70%～80%。培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次3 min。加入Hoechst33258染液染色8 min，PBS洗3洗，每次3 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?，熒光顯微鏡攝片。設(shè)置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI為0.1、0.01）作用24 h。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.5 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞接種于24孔板中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合至70%～80%。用4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton X-100室溫孵育30 min，然后0.3%H2O2室溫孵育20 min。根據(jù)試劑盒說明書配置生物素標(biāo)記液，每孔50μL生物素標(biāo)記液37℃避光孵育60 min，然后每孔加200μL標(biāo)記反應(yīng)終止液室溫孵育10 min。配置Streptavidin-HRP工作液及DAB顯色液，每孔加50μL Streptavidin-HRP工作液室溫孵育30 min，然后每孔加200μL DAB顯色液室溫孵育15 min，PBS洗3次。顯微鏡下觀察攝片。設(shè)置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI為0.1、0.01）作用24 h。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實驗檢測HeLa細(xì)胞遷移能力選取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化為細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合至90%。用10μL移液器在每孔中各劃3條水平的直線，PBS洗去劃掉的漂浮細(xì)胞，在劃痕0、24、48 h后倒置顯微鏡下觀察攝片并測量劃痕寬度。設(shè)置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D。細(xì)胞遷移率（%）=24 h或48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度×100%。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell實驗檢測HeLa細(xì)胞侵襲能力將Matrigel膠置于4℃冰箱中使其變?yōu)橐簯B(tài)，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋（1∶3），每孔60μL Matrigel膠均勻地加入預(yù)冷的Transwell板，37℃放置1 h使其凝固；HeLa細(xì)胞先用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓12 h，胰酶消化并離心，PBS洗3次，細(xì)胞計數(shù)為（1～5）×107個/L，每孔200μL細(xì)胞懸液接種于上室孔中，下室加入500μL DMEM完全培養(yǎng)基。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；吸棄小室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽將Matrigel膠輕輕擦拭，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次；風(fēng)干，置于倒置顯微鏡下觀察攝片。設(shè)置對照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用24 h；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D作用24 h。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot分析細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白F-actin、RhoA和ROCK2的表達(dá)收集NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用時間分別為24、36和48 h的細(xì)胞及對照組的正常細(xì)胞，并提取蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗4℃室孵育過夜；二抗在室溫孵育2 h。GAPDH作為內(nèi)參。DAB顯色液顯色，AI600上機(jī)檢測條帶，用Image J分析并計算灰度值。以上實驗均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDV F3對HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察，對照組HeLa細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常，呈鋪路石狀，折光性佳；NDV F3感染12 h后，細(xì)胞失去正常形態(tài)，邊緣逐漸模糊，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒，部分細(xì)胞有融合現(xiàn)象；感染24 h后，細(xì)胞變圓并脫落，細(xì)胞破裂，并可見一些圓形空泡；感染36 h后，貼壁細(xì)胞剩余較少，大量細(xì)胞碎裂、懸浮，失去折光性。見圖1。

Fig.1 Observation of the morphology of HeLa cells infected by NDV under an ordinary inverted microscope(×100)圖1 普通倒置顯微鏡下觀察NDV感染HeLa細(xì)胞后形態(tài)（×100）

2.2 HeLa細(xì)胞微絲骨架染色NDV F3對細(xì)胞微絲骨架有極大的破壞作用。對照組的正常細(xì)胞微絲骨架無聚集且均勻排列，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)正常。病毒感染后可引起細(xì)胞骨架重組，微絲骨架有聚合的現(xiàn)象，呈小團(tuán)塊聚集，形成網(wǎng)絡(luò)空洞狀態(tài)，并且細(xì)胞的邊界更加明顯。Cytochalasin D作用后，可見微絲骨架排列紊亂，聚集成團(tuán)，見圖2。

Fig.2 Observation of the microfilament skeleton of HeLa cells under an ordinary inverted microscope(Coomassie Brilliant Blue Staining,×200)圖2 普通倒置顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞微絲骨架（考馬斯亮藍(lán)染色，×200）

2.3 HeLa細(xì)胞的增殖情況CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的NDV F3對HeLa細(xì)胞增殖均有抑制作用，病毒濃度越大對細(xì)胞增殖作用抑制的越明顯（P＜0.05），在NDV F3終濃度為MOI=1和MOI=0.1時抑制效果較明顯；NDV F3作用不同時間之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 HeLa細(xì)胞凋亡情況Hoechst33258染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞核形態(tài)及大小較均一，邊界完整清晰，熒光染色呈勻質(zhì)狀。與對照組相比，NDV F3感染后的HeLa細(xì)胞可見細(xì)胞核聚集固縮，部分細(xì)胞核呈碎塊狀，形成凋亡小體，為細(xì)胞凋亡的特征性改變。熒光染色呈高亮。見圖3。TUNEL檢測結(jié)果顯示，對照組的正常細(xì)胞未被DAB染成棕色，為陰性，NDV F3組細(xì)胞凝集成團(tuán)的部分與DAB結(jié)合顯示為棕色，細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且MOI=0.1時凋亡發(fā)生結(jié)果更為顯著。見圖4。

2.5 HeLa細(xì)胞遷移能力細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示NFV F3對細(xì)胞的遷移能力有抑制作用。與對照組相比，NDV F3終濃度MOI=0.1作用24 h和48 h時對細(xì)胞遷移能力均有抑制作用，并且病毒作用48 h的抑制效果較24 h更加顯著。Cytochalasin D組與對照組相比也有明顯的抑制作用，隨著作用時間的增加，抑制效果更加顯著。見圖5、表2。

Tab.1 Effects of different groups and different duration time on the proliferation of HeLa cells表1 不同分組及不同作用時間對HeLa細(xì)胞增殖的影響

表2各組在劃痕24 h和48 h的遷移率比較Tab.2 The mobility of different groups at 24 h and 48 h after scratch

Fig.3 The effect of NDV F3 on HeLa cell apoptosis(Hoechst33258 Staining,×100)圖3 NDV F3對HeLa細(xì)胞凋亡的影響（Hoechst33258染色，×100）

Fig.4 NDV F3 induced apoptosis of HeLa cells(DAB Staining,×100)圖4 NDV F3誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡（DAB染色，×100）

2.6 HeLa細(xì)胞侵襲能力Transwell實驗結(jié)果顯示NFV F3對細(xì)胞的侵襲能力有抑制作用。與對照組［（548.333±26.951）個/視 野］相 比，NDV F3組［（61.333±23.159）個/視 野］和Cytochalasin D組［（238.667±32.808）個/視野］穿過小室的數(shù)目均明顯減少（n=3，F(xiàn)=233.760，P＜0.01）。見圖6。

2.7 NDV F3對HeLa細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白F-actin、RhoA和ROCK2表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，在NDV F3作用HeLa細(xì)胞24 h時，F(xiàn)-actin、RhoA和ROCK2表達(dá)量較對照組均無明顯差異，而36 h和48 h時3種蛋白的表達(dá)量均較對照組降低（P＜0.01）。見圖7、表3。

Tab.3 Comparison of expression levels of cytoskeletonrelated proteins F-actin,RhoA and ROCK2 between four groups表3 各組間F-actin、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)量比較

3 討論

3.1 NDV治療腫瘤的潛力溶瘤病毒的應(yīng)用是具有潛力的癌癥治療策略。溶瘤病毒可分為基因工程或天然存在的毒株，其通過選擇性感染癌細(xì)胞而不損害未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和正常組織，從而誘導(dǎo)有效的適應(yīng)性抗腫瘤免疫［8-9］。截至目前，溶瘤病毒Onyx-015（中國）和T-VEC（美國）分別被批準(zhǔn)用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［10］和轉(zhuǎn)移性黑素瘤［11］受試者。除此之外，許多其他溶瘤病毒已用于臨床前研究和早期臨床試驗。臨床試驗表明在各種類型實體瘤的癌癥患者中使用野生型NDV毒株進(jìn)行抗腫瘤治療未見嚴(yán)重的不良反應(yīng)［12］。因此，溶瘤性NDV用于癌癥治療可能是一種安全有效的策略。

3.2 NDV F3可通過微絲骨架影響腫瘤細(xì)胞的增殖倒置光學(xué)顯微鏡下觀察NDV感染后的HeLa細(xì)胞有明顯的融合現(xiàn)象，隨著感染時間的延長，細(xì)胞不再貼壁生長并且大量漂浮死亡。CCK-8實驗和Hoechst33258染色確定NDV感染細(xì)胞后的細(xì)胞活性受抑，NDV感染后可以使細(xì)胞膜受損，釋放乳酸脫氫酶，抑制了細(xì)胞增殖，并且細(xì)胞核發(fā)生了固縮、碎裂以及形成凋亡小體，細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步用TUNEL檢測法特異性地觀察到凝集的細(xì)胞團(tuán)可以被DAB特異性結(jié)合，顯示為棕色，證明細(xì)胞發(fā)生凋亡。以上實驗結(jié)果均證明NDV F3感染能抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。Cytochalasin D是一種源于真菌代謝產(chǎn)物的肌動蛋白聚合抑制劑，通過與肌動蛋白纖維正端的結(jié)合來抑制亞基的聚合和解離，從而干擾細(xì)胞的運動、生長及吞噬等多種細(xì)胞生理過程。細(xì)胞骨架由微管、微絲、中間絲構(gòu)成。微絲由Actin和與其結(jié)合的蛋白組成。細(xì)胞的運動、分裂、質(zhì)膜的流動等多種功能都需要Actin的協(xié)調(diào)流動和重建［13］。本研究以Cytochalasin D作為細(xì)胞骨架異常的陽性對照，通過對細(xì)胞微絲骨架的染色發(fā)現(xiàn)NDV F3作用HeLa細(xì)胞后細(xì)胞微絲骨架發(fā)生聚集現(xiàn)象且排列紊亂。Rho家族蛋白是Actin的上游調(diào)控因子。研究顯示，Rho家族蛋白具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制凋亡的作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著促進(jìn)作用［14］。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，細(xì)胞骨架內(nèi)的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，細(xì)胞骨架重組，形成凋亡微管網(wǎng)及凋亡小體［15］。

3.3 NDV F3可通過微絲骨架影響腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲惡性腫瘤致死率高主要是因為腫瘤細(xì)胞具備了遷移和侵襲的能力，能夠穿透基底膜并到達(dá)間質(zhì)，完成上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）這一癌變過程，然后隨著血液和淋巴轉(zhuǎn)移［16］。細(xì)胞骨架與腫瘤的遷移與侵襲密切相關(guān)［5］。RhoA/ROCK信號通路是參與微絲骨架改變的一條重要通路。RhoA不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)，還可以通過與GTP酶結(jié)合活化下游效應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，從而影響細(xì)胞遷移［17］。ROCK是RhoA蛋白重要的下游效應(yīng)器，通過磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）和肌球蛋白磷酸酶亞基1（MYPT1），影響肌動蛋白與肌球蛋白的交聯(lián)以及肌動蛋白微絲骨架的聚合，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞骨架微絲和偽足等Factin樣結(jié)構(gòu)形態(tài)改變，導(dǎo)致微絲骨架重組等多種生物學(xué)行為［18-19］。本研究中，劃痕和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)NDV F3對HeLa細(xì)胞的遷移率和侵襲數(shù)目均有抑制作用，Western blot檢測F-acin、RhoA和ROCK的蛋白表達(dá)量均有降低的趨勢，提示NDV的作用可能破壞了細(xì)胞骨架內(nèi)的結(jié)構(gòu)，影響微絲骨架的聚合，從而破壞了細(xì)胞的遷移及侵襲能力。其機(jī)制可能與RhoA/ROCK信號通路有關(guān)。

綜上所述，NDV F3可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與破壞細(xì)胞微絲骨架等結(jié)構(gòu)的完整性與功能有關(guān)。此外，NDV F3作用HeLa細(xì)胞后對細(xì)胞的遷移與侵襲能力均有抑制作用，其機(jī)制可能與細(xì)胞微絲骨架蛋白相關(guān)的RhoA/ROCK信號通路有關(guān)。

Fig.5 Changes in migration distance of each group of cells after scratching(×100)圖5 各組細(xì)胞劃痕后遷移距離的變化（×100）