李靜，韓永凱，蘇靜，朱欣茹，宋景貴△

腦卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是腦卒中常見并發(fā)癥，表現(xiàn)為情緒低落、興趣減退、淡漠、反應(yīng)遲鈍等，至少1/3的腦卒中患者會出現(xiàn)心境改變［1］。臨床常用的氟西汀、曲唑酮等藥物治療時間長且可能增加復(fù)發(fā)風(fēng)險，因此需要尋找更為安全、有效、實用的治療方法［2］。微小RNA（microRNA，miR）在腫瘤、心肌梗死、腦卒中、癲癇等疾病中參與多條信號通路，是腦卒中診斷、治療及預(yù)后的新型生物標(biāo)志物［3］。其中miR-134在腦組織中可通過改變樹突棘的大小調(diào)節(jié)突觸傳遞，研究發(fā)現(xiàn)在大腦海馬組織中miR-134表達(dá)升高可降低突觸可塑性和神經(jīng)相關(guān)靶基因如環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，引發(fā)癲癇等疾?。?］；而CREB、BDNF均為抗抑郁基因，其表達(dá)水平可直接反映抑郁情況［5］。筆者推測抑制miR-134的表達(dá)可緩解PSD的進(jìn)展。因此，本研究通過觀察下調(diào)miR-134表達(dá)對PSD模型大鼠的影響，以期為PSD的基因治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細(xì)胞SPF級健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量220～240 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2017-0011；使用許可證號：SCXK（京）2018-0009］。所有動物均在溫度（24.0±0.5）℃、濕度40%～60%、12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中正常飲食飲水，實驗經(jīng)本院倫理協(xié)會審核并通過，倫理審批號：20180060015，整個動物實驗期間嚴(yán)格遵循實驗動物3R原則。實驗細(xì)胞HEK-293T購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑與儀器miRNA拮抗劑陰性對照（antagomir NC）、miR-134拮抗劑（miR-134 antagomir）、miR-134模擬物（miR-134 mimic）、mimic陰 性對照（mimic NC）、野生型（CREB-WT）和對應(yīng)突變型（CREB-MUT）重組載體均購自上海吉瑪基因股份有限公司；引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成；蔗糖（批號20190553）購自上海佰曄生物科技公司。實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（批號20170526）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CREB（批號20180156）、BDNF（批號20170403）免疫組化染色試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號20185315）購自英國Abcam公司，qPCR儀購自美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及PSD大鼠模型建立實驗動物編號后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、antagomir NC組、miR-134 antagomir組，每組8只。除假手術(shù)組外，其余各組參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行大腦中動脈阻塞（MCAO）術(shù)，第2天經(jīng)慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）誘導(dǎo)建立PSD模型。假手術(shù)組除不插入線栓外其他操作相同。術(shù)后24 h按照Longa等［7］建立的評分標(biāo)準(zhǔn)，評分≥1分且＜4分納入研究。MCAO術(shù)后第2天行CUMS前antagomir NC組、miR-134 antagomir組用立體定位儀定位雙側(cè)海馬區(qū)并分別注射5μL antagomir NC、miR-134 antagomir（1μmol/L），之后5 d注射1次，連續(xù)5次。假手術(shù)組、模型組相同部位注射等體積生理鹽水。

1.2.2 各組大鼠體質(zhì)量變化分別在CUMS應(yīng)激前，應(yīng)激第7、14、21天測各組大鼠體質(zhì)量。

1.2.3 動物敞箱實驗評價大鼠運動行為改變實驗在安靜環(huán)境下進(jìn)行，參考Papp等［8］所用敞箱，制作長寬均為80 cm、高40 cm敞箱，箱體四周為黑色，在敞箱白色底板上用黑色筆畫出面積相等的25格。大鼠稱質(zhì)量后將大鼠置于敞箱中，記錄5 min內(nèi)大鼠穿越地面方塊數(shù)（四爪跨入，即為水平活動得分）和直立總次數(shù)（兩前肢均離地且1 cm以上，即為垂直活動得分）。

1.2.4 蔗糖偏愛實驗評價大鼠快感缺乏行為改變所有大鼠在未分組前進(jìn)行3次蔗糖偏愛實驗訓(xùn)練，即在第1個24 h內(nèi)每個籠中放置2個水瓶，均裝1%蔗糖水；在第2個24 h內(nèi)1個水瓶裝1%蔗糖水、1個水瓶裝純凈水。借鑒Willner等［9］方法并加以改進(jìn)，動物敞箱實驗結(jié)束后進(jìn)行蔗糖偏愛實驗。實驗前禁食禁水24 h，1個水瓶裝1%蔗糖水、1個水瓶裝純凈水，1 h后稱量剩余1%蔗糖水、純凈水量。計算糖水飲用比例=1%蔗糖水消耗量/（1%蔗糖水消耗量+純凈水消耗量）×100%。

1.2.5 qPCR檢測海馬CA1區(qū)miR-134、CREB、BDNF mRNA表達(dá)應(yīng)激第21天蔗糖偏愛實驗結(jié)束后立即處死大鼠，分離海馬CA1區(qū)組織，部分置于4%多聚甲醛中固定做免疫組化染色，部分置于Trizol中研磨檢測miR-134、CREB、BDNF mRNA水平。組織經(jīng)研磨后參照qPCR試劑盒說明書進(jìn)行實驗。引物序列見表1。反應(yīng)體系20μL：cDNA 1μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，2×Mix 10μL，ddH2O 8.0μL。反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，62℃45 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-134、CREB、BDNF mRNA表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 免疫組化染色檢測海馬CA1區(qū)CREB、BDNF蛋白表達(dá)情況取固定好的海馬CA1區(qū)組織，4μm切片后經(jīng)脫蠟、水化、熱修復(fù)抗原、5%脫脂奶粉封閉，滴加一抗CREB（1∶500）、BDNF（1∶5 000）孵育2 h，滴加二抗20 min后DAB顯色，蘇木素復(fù)染核，分色、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄CREB、BDNF陽性細(xì)胞數(shù)，每張切片選5個視野，取平均值。

1.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炶b定CREB與miR-134的靶向關(guān)系Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）分析顯示CREB 3'UTR序列上存在miR-134潛在結(jié)合位點，見圖1。因此構(gòu)建含miR-134潛在結(jié)合位點的CREB-WT和CREBMUT，分別與miR-134 mimic或miR-134 mimic NC共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對活性，驗證CREB與miR-134的靶向關(guān)系。

Fig.1 Targetscan predicts the specific binding site of miR-134 to CREB圖1 Targetscan預(yù)測miR-134與CREB的特異性結(jié)合位點

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠體質(zhì)量情況比較應(yīng)激前4組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)激第7、14、21天，與假手術(shù)組相比，模型組和antagomir NC組大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05）；與模型組和antagomir NC組相比，miR-134 antagomir組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Changes of body mass during the experiment in four groups of rats表2 4組大鼠實驗期間體質(zhì)量變化

2.2 4組大鼠運動行為改變見表3。動物敞箱實驗結(jié)果顯示，應(yīng)激前，模型組、antagomir NC組、miR-134 antagomir組水平和垂直活動得分均較假手術(shù)組降低（P＜0.05）。應(yīng)激第7、14、21天，模型組和antagomir NC組水平和垂直活動得分仍較假手術(shù)組降低（P＜0.05），miR-134 antagomir組與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組、antagomir NC組相比，miR-134 antagomir組應(yīng)激第14、21天水平、垂直活動得分升高（P＜0.05）。

Tab.3 Comparison of the movement between four groups of rats表3 4組大鼠運動情況比較

2.3 4組大鼠蔗糖偏愛實驗結(jié)果 應(yīng)激前和應(yīng)激第7天，4組大鼠糖水飲用比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)激第14天，與假手術(shù)組相比，模型組、antagomir NC組和miR-134 antagomir組糖水飲用比例下降（P＜0.05）；應(yīng)激第21天，與假手術(shù)相比，模型組和antagomir NC組糖水飲用比例下降（P＜0.05），miR-134 antagomir組糖水飲用比例高于模型組和antagomir NC組（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of sugar water drinking ratio between four groups of rats表4 4組大鼠糖水飲用比例比較

2.4 4組大鼠海馬CA1區(qū)miR-134、CREB、BDNF mRNA表達(dá)水平變化與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海 馬CA1區(qū)miR-134水 平 升高，CREB、BDNF mRNA水平降低（P＜0.05）；與模型組和antagomir NC組相比，miR-134 antagomir組海馬CA1區(qū)miR-134水平降低，CREB、BDNF mRNA水平升高（P＜0.05）。見表5。

Tab.5 Comparison of miR-134,CREB,BDNF mRNA levels in hippocampal CA1 area between 4 groups of rats表5 4組大鼠海馬CA1區(qū)miR-134、CREB、BDNF mRNA水平比較

2.5 4組大鼠海馬CA1區(qū)CREB、BDNF蛋白表達(dá)變化免疫組化染色結(jié)果顯示，CREB陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕色且多數(shù)位于細(xì)胞核，BDNF陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕色斑塊，多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)，少量位于神經(jīng)突起。與假手術(shù)組相比，模型組海馬CA1區(qū)CREB、BDNF陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與模型組和antagomir NC組相比，miR-134 antagomir組海馬CA1區(qū)CREB、BDNF陽性細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05）。見表6、圖2。

Tab.6 Comparison of CREB and BDNF positive cells in hippocampal CA1 area between four groups of rats表6 4組大鼠海馬CA1區(qū)CREB、BDNF陽性細(xì)胞數(shù)比較

2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果與miR-134 mimic NC+CREB-WT組 相 比，miR-134 mimic+CREB-WT組共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶相對活性下降（n=6，0.99±0.11vs.0.43±0.07，t=10.521，P＜0.05）；miR-134 mimic NC+CREB-MUT與miR-134 mimic+CREB-MUT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，1.03±0.10vs.1.01±0.11，t=0.330，P＞0.05），證明CREB序列上存在miR-134特異結(jié)合位點。

Fig.2 CREB and BDNF protein expressions in hippocampal CA1 area of 4 groups of rats(Immunohistochemistry staining,×200)圖2 4組大鼠海馬CA1區(qū)CREB、BDNF蛋白表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

3 討論

PSD是多種精神和軀體癥狀綜合的復(fù)雜性情感障礙疾病，會引發(fā)注意力低下、學(xué)習(xí)及執(zhí)行力降低、肢體功能和生活質(zhì)量下降等，同時造成神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重時導(dǎo)致患者自殺［10］，早期有效的治療對于緩解疾病意義重大。在眾多造成抑郁的病因中，MCAO后創(chuàng)傷性應(yīng)激是主要原因之一［11］。因此，本文采用MCAO后CUMS誘導(dǎo)建立PSD大鼠模型，在應(yīng)激前，應(yīng)激第7、14、21天分別稱量動物體質(zhì)量、進(jìn)行動物敞箱實驗和蔗糖偏愛實驗，從而評價大鼠抑郁樣行為。與假手術(shù)組相比，模型組在應(yīng)激后體質(zhì)量減輕，運動狀況、飲用糖水情況均降低，抑郁樣行為加重。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，miRNA靶向治療優(yōu)勢明顯，miRNA可特異性地靶向目標(biāo)片段或目標(biāo)3'-UTR突變體，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響疾病的進(jìn)展［12］。且miRNA在組織、細(xì)胞、血液中能夠穩(wěn)定表達(dá)，相較于各類神經(jīng)生化遞質(zhì)、細(xì)胞因子等，更適合作為生物標(biāo)志物［13］。研究發(fā)現(xiàn)miR-134可參與樹突棘大小變化、神經(jīng)元可塑性等過程來影響腦發(fā)育；miR-134的靶基因LIM區(qū)域激酶1（LIMK1）可影響樹突棘的大小，當(dāng)miR-134水平升高時抑制LIMK1 mRNA翻譯，從而導(dǎo)致樹突棘變小，而樹突棘作為神經(jīng)元樹突上功能性突起，參與大腦學(xué)習(xí)記憶功能，且與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切［14-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組海馬CA1區(qū)miR-134水平升高，提示在PSD海馬CA1區(qū)miR-134導(dǎo)致樹突棘變小，神經(jīng)功能改變，大鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為。而在模型組基礎(chǔ)上注射miR-134 antagomir后，抑郁樣行為得以減緩，推測miR-134可能為疾病治療靶位點之一，具有一定改善抑郁的作用。

CREB是細(xì)胞核內(nèi)重要轉(zhuǎn)錄因子，CREB活化后在突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等方面發(fā)揮重要作用，是神經(jīng)通路重要靶點［17］；BDNF可解除LIMK1的抑制作用，從而誘導(dǎo)樹突棘生長［18］。CREB可通過促進(jìn)BDNF的表達(dá)，加速神經(jīng)突觸重塑和神經(jīng)元生長，有助于抑郁癥的治療［19］。研究發(fā)現(xiàn)在癲癇大鼠中miR-134的表達(dá)水平下降，CREB、突觸核蛋白11（SYT11）表達(dá)水平升高，干擾miR-134可使CREB、SYT11的表達(dá)升高，并伴隨大鼠癲癇發(fā)作頻率增多、程度加重［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組海馬CA1區(qū)CREB、BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，提示PSD海馬CA1區(qū)CREB表達(dá)降低可同時降低對BDNF的促進(jìn)作用，從而使BDNF對LIMK1的抑制作用減弱，導(dǎo)致樹突棘生長受到抑制，進(jìn)而影響神經(jīng)功能。與模型組相比，miR-134 antagomir組海馬CA1區(qū)CREB、BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Targetscan預(yù)測miR-134與CREB可能存在特異性結(jié)合位點，經(jīng)雙熒光素酶驗證CREB序列上確實存在miR-134特異結(jié)合位點，提示抑制miR-134的表達(dá)可靶向促進(jìn)CREB的mRNA翻譯，從而促進(jìn)抗抑郁基因BDNF的表達(dá)，解除LIMK1的抑制，進(jìn)而實現(xiàn)抗PSD作用。

綜上所述，抑制miR-134的表達(dá)可能靶向促進(jìn)CREB/BDNF通路蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗抑郁作用，實現(xiàn)對PSD大鼠的保護(hù)，但miR-134靶向信號通路不止一個，亦可能通過其他信號通路實現(xiàn)對PSD大鼠的保護(hù)，這是今后的研究重點。