程凌雪，范永強(qiáng)，侯超，李文波

胃食管反流?。╣astroesophaeal reflux disease，GERD）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性疾病，嚴(yán)重影響患者的心理和生活質(zhì)量。我國(guó)GERD發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。目前GERD的治療以質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）抑酸為主，但有高達(dá)30%的患者對(duì)PPI治療反應(yīng)欠佳［2］，尋求新的GERD防治策略很有必要。食管黏膜上皮屏障功能損害是GERD的重要發(fā)病機(jī)制［3］。當(dāng)屏障功能受損時(shí)，細(xì)胞通透性增加并出現(xiàn)細(xì)胞間隙增寬，胃十二指腸內(nèi)容物逆行彌散進(jìn)入上皮層，損害食管黏膜，從而產(chǎn)生GERD的臨床癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）可調(diào)控食管黏膜上皮屏障功能，敲除小鼠Nrf2會(huì)降低其食管黏膜上皮的跨上皮電阻抗（transepithelial electrical impedance，TEER）和增加食管黏膜上皮的細(xì)胞間隙，故而小鼠出現(xiàn)食管黏膜上皮屏障功能下降［4］。2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9-二烯-28-酸甲酯（2-cyano-3，12-dioxooleana-1，9-dien-28-oic acid，CDDO-Me）是一種合成的齊墩果烷三萜類化合物，是有效的Nrf2激活劑，并可增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)［5］。CDDO-Me是否可通過(guò)激活Nrf2途徑增強(qiáng)食管黏膜上皮的屏障功能，目前尚少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以Het-1A細(xì)胞系建立食管黏膜上皮屏障模型，觀察CDDO-Me對(duì)食管黏膜屏障的保護(hù)效應(yīng)，探討CDDO-Me作為黏膜屏障增強(qiáng)劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑Het-1A細(xì)胞（永生化人食管鱗狀上皮細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)（ATCC）。倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；低速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；細(xì)胞電阻儀Millicell ERS-2購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；共培養(yǎng)小室、細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Corning公司；培養(yǎng)基BEBM、BEGM Single Quots購(gòu)自瑞士LonzA公司；血清、L-15、Trypsin-EDTA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó)EQUITECH-BIO公司；CDDOMe、纖連蛋白（fibronectin）、牛Ⅰ型膠原蛋白（bovine collagen typeⅠ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Het-1A細(xì)胞培養(yǎng)Het-1A細(xì)胞接種到包被好的培養(yǎng)方瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞的密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代，加入1 mL Trypsin-EDTA溶液（含0.5%聚乙烯吡咯烷酮，PVP）消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，消化5～10 min，可看到細(xì)胞相互分離變圓，即消化完成；加入3 mL含0.1% FBS的L-15終止消化，用BEBM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，按1∶3的比例接入包被好的方瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 酸處理細(xì)胞共培養(yǎng)小室包被，過(guò)夜后PBS潤(rùn)洗2遍；提前1 d使用3%的鹽酸調(diào)整培養(yǎng)基pH分別為4、5、6；取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Het-1A細(xì)胞，加入胰蛋白酶Trypsin-EDTA（含0.5%PVP）消化細(xì)胞成細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL，在共培養(yǎng)小室上室加入1 mL細(xì)胞懸液，下室加入1 mL無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；待共培養(yǎng)小室上室細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按照實(shí)驗(yàn)分組，即pH4組、pH5組、pH6組、對(duì)照組，分別用pH為4、5、6的培養(yǎng)基及正常培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，37℃、5%CO2飽和濕度條件下分別培養(yǎng)5、10、30、60 min后上下室培養(yǎng)基全更換為正常培養(yǎng)基（包括對(duì)照組），每組3個(gè)復(fù)孔，每孔選3個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)各小室的電阻，同時(shí)設(shè)空白組；記錄每次檢測(cè)的電阻值。

1.2.3 CDDO-Me處理細(xì)胞待共培養(yǎng)小室上室細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按CDDO-Me濃度分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，即用含0、0.25、0.5、1、2.5、5μmol/L CDDO-Me的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6、12、24、48 h，37℃、5%CO2飽和濕度條件下分別培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間后，再以酸處理細(xì)胞篩選出TEER較對(duì)照組變化最大的pH值及處理時(shí)間繼續(xù)培養(yǎng)，即pH為4的培養(yǎng)基培養(yǎng)60 min，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔選3個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)各小室的電阻，同時(shí)設(shè)空白組；記錄每次檢測(cè)的電阻值。

1.2.4 細(xì)胞TEER計(jì)算根據(jù)檢測(cè)所得的電阻值，依次計(jì)算各復(fù)孔電阻值的平均值（R總），根據(jù)公式計(jì)算每個(gè)組Het-1A細(xì)胞的TEER：TEER（Ω·cm2）=（R總-R空白）×膜面積，有效膜面積0.6 cm2。分析各組細(xì)胞TEER變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多個(gè)時(shí)間點(diǎn)阻抗變量統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，分析某一因素時(shí)多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，其中組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Het-1A細(xì)胞生長(zhǎng)情況倒置顯微鏡下觀察，Het-1A細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)飽滿，排列緊密，可作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Light microscope observation of the cell growth(×100)圖1 光鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況（×100）

2.2 不同酸度和作用時(shí)間對(duì)食管上皮細(xì)胞TEER的影響重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果示，球形檢驗(yàn)結(jié)果滿足球形分布假設(shè)（P＞0.05），不同處理時(shí)間（F=100.695）、不同pH處理因素（F=55.532）、pH和處理時(shí)間的交互作用（F=12.672）對(duì)TEER值的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），因此，分析pH和作用時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng)。

對(duì)照組中，不同處理時(shí)間TEER比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。pH為4、5、6時(shí)，不同處理時(shí)間對(duì)Het-1A細(xì)胞的TEER作用比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），隨著處理時(shí)間（10、30、60 min）的延長(zhǎng)，TEER下降幅度越大。處理時(shí)間為5 min時(shí)，各組TEER比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；處理時(shí)間為10、30、60 min時(shí)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以pH4組60 min時(shí)TEER下降最明顯，見(jiàn)表1。

Tab.1 Changes of cell TEER values at different time points between different pH treatment groups表1 各pH處理組間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

Tab.1 Changes of cell TEER values at different time points between different pH treatment groups表1 各pH處理組間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與pH4組比較，A與同組30 min時(shí)比較，P＜0.05

組別對(duì)照組pH4組pH5組pH6組F 5 min 62.53±2.27 57.33±4.00 59.93±1.92 62.53±1.63 2.701 10 min 62.27±3.07 49.53±0.90a 54.80±2.50ab 57.67±2.72 14.286＊＊30 min 64.27±1.40 40.87±3.35a 49.27±3.97ab 53.00±2.11a 33.869＊＊60 min 61.20±3.14 29.93±2.89aA 41.13±2.02abA 46.47±2.76aA 67.667＊＊F 0.732 45.681＊＊26.078＊＊25.480＊＊

2.3 不同濃度及作用時(shí)間的CDDO-Me預(yù)刺激對(duì)食管上皮細(xì)胞TEER的影響球形檢驗(yàn)結(jié)果滿足球形分布假設(shè)（P＞0.05），不同處理時(shí)間（F=50.045）、不同CDDO-Me濃度（F=32.357）、CDDO-Me濃度和處理時(shí)間的交互作用（F=7.907）對(duì)TEER值的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），因此，分析CDDO-Me濃度和處理時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng)。

處理時(shí)間6 h時(shí)，不同濃度CDDO-Me預(yù)刺激組TEER比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。12、24、48 h時(shí)，不同濃度CDDO-Me預(yù)刺激組TEER比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24 h時(shí)，隨著刺激濃度的增加，各組TEER逐漸升高，以5μmol/L組最明顯（P＜0.05）。CDDO-Me預(yù)刺激濃度為0.25μmol/L時(shí)，各時(shí)點(diǎn)TEER比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；濃度為0.5、1、2.5、5μmol/L時(shí)，各時(shí)點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；濃度為2.5μmol/L時(shí)，24 h、48 h TEER值均較前一時(shí)點(diǎn)升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Changes of cell TEER values at different time points between different CDDO-Me pre-stimulated concentrations表2 各CDDO-Me預(yù)刺激濃度間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

Tab.2 Changes of cell TEER values at different time points between different CDDO-Me pre-stimulated concentrations表2 各CDDO-Me預(yù)刺激濃度間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞TEER的變化 （n=3，Ω·cm2，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與0.5μmol/L組比較，c與1μmol/L比較，d與2.5μmol/L組比較，A與同組6 h比較，B與同組12 h比較，C與同組24 h比較，P＜0.05

組別對(duì)照組0.25μmol/L組0.5μmol/L組1μmol/L組2.5μmol/L組5μmol/L組F 6 h 25.60±3.67 27.53±3.91 24.13±5.12 22.47±3.26 26.20±4.39 30.20±4.30 1.260 12 h 23.67±2.32 25.53±3.86 29.27±3.36 28.07±4.97 32.73±4.37a 35.27±4.57a 3.540＊24 h 23.80±3.56 26.40±2.23 31.00±1.31aA 37.87±3.41abA 43.73±3.93acAB 50.20±2.65abcdA 35.701＊＊48 h 23.47±1.85 27.00±2.91 34.00±2.46aA 42.47±4.39aA 51.60±2.43aABC 49.87±2.57aA 50.284＊＊F 0.335 0.203 4.539＊15.016＊＊25.711＊＊23.549＊＊

3 討論

食管上皮屏障包括結(jié)構(gòu)屏障和功能屏障兩類［6］。結(jié)構(gòu)屏障包括角質(zhì)層上皮細(xì)胞的管腔側(cè)細(xì)胞膜和上皮細(xì)胞間連接復(fù)合物。功能屏障包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間緩沖體系、細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。食管上皮作為屏障，將有害的酸性反流物限制在食管腔內(nèi)，并將其與食管傷害感受器分開(kāi)［7］。食管上皮是非角化的復(fù)層鱗狀上皮，提供滲透性屏障。在食管上皮細(xì)胞之間存在緊密的細(xì)胞間連接，以維持食管上皮屏障的完整性并限制細(xì)胞旁離子擴(kuò)散［8］。

反流刺激物（如反流的胃酸）最初通過(guò)攻擊細(xì)胞間連接復(fù)合物而導(dǎo)致食管上皮損傷，從而導(dǎo)致跨膜屏障功能降低以及細(xì)胞通透性增加［9］。研究表明，反流物刺激食管黏膜產(chǎn)生氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)，造成食管上皮屏障功能障礙［10］。反流物可通過(guò)直接或間接作用損傷食管黏膜上皮屏障，其中胃酸是主要損傷因素［11］。研究證實(shí)，當(dāng)食管黏膜屏障受損時(shí)，離子通透性增加，TEER降低［12］。因此，本研究通過(guò)測(cè)量細(xì)胞TEER來(lái)評(píng)估食管黏膜上皮屏障功能的完整性。

本研究發(fā)現(xiàn)弱酸損傷食管上皮屏障功能，以pH4組60 min時(shí)TEER下降最明顯，提示酸度越強(qiáng)，接觸時(shí)間越長(zhǎng)，食管上皮功能損傷越重。Farre等［13］研究發(fā)現(xiàn)，食管黏膜暴露于酸性和弱酸性溶液，出現(xiàn)細(xì)胞間隙擴(kuò)張，進(jìn)而損傷食管黏膜完整性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其參與的信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激機(jī)制［14］。在正常生理?xiàng)l件下，Nrf2與其生理抑制劑Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合［15］。Keap1通過(guò)蛋白-蛋白酶體途徑介導(dǎo)Nrf2的降解。當(dāng)活性氧過(guò)表達(dá)或親電性物質(zhì)刺激時(shí)，Keap1失活，導(dǎo)致Nrf2從蛋白酶體途徑中釋放出來(lái)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，隨后Nrf2與小的Maf蛋白形成異二聚體，并與靶基因的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，防止細(xì)胞凋亡［16］。

抗氧化反應(yīng)中的Keap1-Nrf2軸發(fā)揮關(guān)鍵作用，而CDDO-Me具有影響Keap1構(gòu)象變化的能力，從而降低其催化Nrf2進(jìn)行降解的能力，上調(diào)Nrf2，發(fā)揮抗氧化作用，因此該軸可作為CDDO-Me在疾病治療中使用的基礎(chǔ)模型［17］。作為一種無(wú)細(xì)胞毒性和多功能的藥物，CDDO-Me已在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用于氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病如慢性腎病和癌癥的治療［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me對(duì)于酸對(duì)食管黏膜上皮屏障的損害有保護(hù)作用，其保護(hù)效應(yīng)與CDDO-Me的濃度及作用時(shí)間有關(guān)。CDDO-Me用于胃食管反流病治療具有潛力，但其療效和安全性需更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，酸損害食管上皮屏障功能，與酸度和作用時(shí)間有關(guān)；CDDO-Me可干預(yù)酸損害食管上皮屏障功能，對(duì)食管黏膜上皮屏障具有保護(hù)作用。本研究為探索CDDO-Me作為藥物治療胃食管反流病奠定了基礎(chǔ)。