王 瑾,呂 睿,陳海霞,穆曉環(huán),白曉紅

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心,天津市女性生殖健康與優(yōu)生實(shí)驗(yàn)室,天津 300052;*通訊作者,E-mail:bxhjj@163.com)

隨著輔助生殖技術(shù)的進(jìn)步、冷凍保存技術(shù)的改進(jìn)以及胚胎移植時(shí)間的選擇,使得過(guò)去近20年來(lái)冷凍胚胎移植的使用大大增加[1]。同時(shí),胚胎培養(yǎng)條件的改善使囊胚期的胚胎得到更多的使用[2-4]。目前體外培養(yǎng)為囊胚移植提供了最大的支持,這就為實(shí)現(xiàn)健康懷孕和安全分娩的可能提供了技術(shù)支持。同時(shí),囊胚移植后的種植率和妊娠率高[5],所以越來(lái)越多的中心也優(yōu)先考慮囊胚移植。另外,胚胎在體外的生長(zhǎng)過(guò)程中,需要一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)其發(fā)育狀態(tài)的好壞,所以目前大部分中心都是利用胚胎/囊胚的形態(tài)學(xué)來(lái)評(píng)定胚胎/囊胚是否優(yōu)質(zhì),但是形態(tài)學(xué)的評(píng)分是人為主觀、且只評(píng)價(jià)觀察當(dāng)時(shí)的胚胎/囊胚的狀態(tài),并不能完全代表胚胎/囊胚的發(fā)育潛能。對(duì)于獲卵數(shù)較多或者第3天(D3)擁有較少形態(tài)學(xué)高評(píng)分胚胎的患者,囊胚培養(yǎng)就非常必要。囊胚培養(yǎng)延長(zhǎng)了胚胎的體外培養(yǎng)時(shí)間,提供了更長(zhǎng)時(shí)間自我選擇的機(jī)會(huì),使得胚胎能夠充分的發(fā)揮發(fā)育的潛能[6]。針對(duì)D3形態(tài)學(xué)評(píng)分較低的胚胎行囊胚培養(yǎng)后,囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)解凍移植臨床妊娠結(jié)局影響的研究較少。本研究通過(guò)分析囊胚解凍移植周期的囊胚及其D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分,探討D3形態(tài)學(xué)評(píng)分較低的胚胎形成囊胚的發(fā)育潛力及其移植后的臨床妊娠結(jié)局,同時(shí)為解凍周期的囊胚選擇提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析自2019年1月至2020年4月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心解凍移植周期共602個(gè)周期和新鮮周期囊胚培養(yǎng)D3高評(píng)分111個(gè)周期和低評(píng)分613個(gè)周期。

納入標(biāo)準(zhǔn):①移植D3優(yōu)質(zhì)胚胎的解凍周期;②至少移植1枚囊胚的解凍周期;③D3高評(píng)分納入標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的胚胎;D3低評(píng)分納入標(biāo)準(zhǔn):2PN來(lái)源,卵裂球數(shù)目4-13個(gè),胚胎碎片≤25%,無(wú)多核情況。

本研究根據(jù)D3胚胎和囊胚的評(píng)分情況進(jìn)行分組，具體見(jiàn)圖1。D3組為D3優(yōu)質(zhì)胚胎組(478例),D3胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成的囊胚分為D3形態(tài)學(xué)評(píng)分高組(HD3B組,58例)和形態(tài)學(xué)評(píng)分低組(LD3B組,66例)。再根據(jù)囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分將HD3B組和LD3B組分為H1/L1組優(yōu)質(zhì)囊胚組(23/8例),H2/L2組優(yōu)質(zhì)+非優(yōu)質(zhì)可用囊胚(1 ∶1)組(1/2例),H3/L3組非優(yōu)質(zhì)可用囊胚組(34/54例),H4/L4組劣質(zhì)囊胚組(0/2例)。

本回顧性分析中所有體外操作都是不孕夫婦在接受輔助生殖治療中的常規(guī)操作，符合人類輔助生殖技術(shù)的規(guī)范和要求，且在不孕夫婦知情同意的情況下進(jìn)行。

圖1 周期分組流程Figure 1 A process of grouping

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培養(yǎng)方法 本中心的所有胚胎培養(yǎng)液均采用商品化的G-seriesTM培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)。胚胎培養(yǎng)至D3移植或冷凍后,將剩余養(yǎng)囊胚胎移至G2TM-plus液滴中培養(yǎng)至D5或D6。全部培養(yǎng)過(guò)程都置于37 ℃,89%N2、6%CO2和5%O2的三氣培養(yǎng)箱中。

1.2.2 D3胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 本中心根據(jù)Peter評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)D3胚胎進(jìn)行評(píng)分。Ⅰ級(jí):7-9細(xì)胞,卵裂球大小均勻,形狀規(guī)則,胞質(zhì)均勻,無(wú)粗顆?，F(xiàn)象,胞質(zhì)內(nèi)碎片<10%;Ⅱ級(jí):7-9細(xì)胞,卵裂球大小稍有不均,形狀稍有不規(guī)則,稍有顆粒現(xiàn)象,碎片10%-15%之間;Ⅲ級(jí):7-9細(xì)胞,卵裂球大小明顯有不均,形狀明顯不規(guī)則,明顯有顆?，F(xiàn)象,碎片15%-25%之間;Ⅳ級(jí):卵裂球極不均勻,形狀極不規(guī)則,胞質(zhì)極不均勻,顆?，F(xiàn)象嚴(yán)重,碎片>25%。本研究將Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)定為評(píng)分高的胚胎。

1.2.3 囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)囊胚評(píng)級(jí)。本研究將優(yōu)質(zhì)囊胚定義為3級(jí)及以上,且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)級(jí)都在B級(jí)及以上的囊胚;而2級(jí)或3級(jí)且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞有一處評(píng)級(jí)在C級(jí)定義為非優(yōu)質(zhì)可用囊胚;2級(jí)以下的囊胚為劣質(zhì)囊胚。

1.2.4 胚胎及囊胚的冷凍與解凍 本實(shí)驗(yàn)室均實(shí)行玻璃化冷凍方法進(jìn)行胚胎及囊胚冷凍。冷凍及解凍的操作均按照日本加藤公司的玻璃化冷凍、解凍套裝說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備 子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備方案分為:①自然周期;②人工周期;③降調(diào)+人工周期。

1.2.6 移植后妊娠結(jié)局的判斷 移植后28 d陰道超聲觀察到孕囊判定為臨床妊娠;移植后14 d血液β-hCG的含量>10 IU/ml判定為生化妊娠,含量為≤10 IU/ml判定為未妊娠。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

總結(jié)分析女性患者一般臨床資料、助孕指標(biāo)及囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、非優(yōu)質(zhì)可用囊胚率、解凍存活率、解凍完整率、種植率、臨床妊娠率、生化妊娠率和流產(chǎn)率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 新鮮周期D3胚胎囊胚形成情況

新鮮周期將挑選D3胚胎冷凍或新鮮移植后的不同評(píng)分胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)本中心的囊胚培養(yǎng)情況,共395枚D3形態(tài)學(xué)高評(píng)分的胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng),囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、非優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和劣質(zhì)囊胚形成率分別為60.51%(239/395),49.11%(194/395),19.25%(46/239),61.92%(148/239)和18.83%(45/239);D3低評(píng)分胚胎2 415枚進(jìn)行囊胚培養(yǎng),囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、非優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和劣質(zhì)囊胚形成率分別為14.74%(356/2 415),12.7%(307/2 415),8.99%(32/356),77.25%(275/356)和13.76%(49/356)。兩組的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和非優(yōu)質(zhì)囊胚形成率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001或P<0.05),劣質(zhì)囊胚形成率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表1)。

表1 新鮮周期D3胚胎囊胚形成情況

2.2 解凍移植周期各組患者一般臨床資料情況比較

在解凍移植周期中,移植D3優(yōu)質(zhì)胚胎的D3組,移植上述新鮮周期D3不同評(píng)分形成囊胚的HD3B組和LD3B組,將三組患者的女方年齡、女方不孕年限、女方的不孕類型以及解凍移植周期的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植日的內(nèi)膜類型和內(nèi)膜厚度進(jìn)行比較,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在上述方面,除在年齡方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2)。

2.3 解凍移植周期三組臨床妊娠結(jié)局情況比較

三組間解凍存活率和解凍完整率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但HD3B組和LD3B組平均移植胚胎數(shù)D3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。HD3B組和LD3B組移植的囊胚質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);三組間種植率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HD3B組和LD3B組種植率高于D3組(P<0.001或P<0.01),而HD3B組與LD3B組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);HD3B組臨床妊娠率高于D3組(P<0.05),而LD3B組與其他兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);三組間流產(chǎn)率、生化妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表3)。

表2 解凍移植周期三組患者基本情況的比較

表3 解凍移植周期三組胚胎妊娠情況比較

HD3B組和LD3B組中評(píng)分同等級(jí)的囊胚移植后臨床妊娠結(jié)局的比較H1組和L1組種植率和妊娠率分別比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);H2組和L2組、H4組和L4組由于組中存在0個(gè)周期,所以不做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較;H3組和L3組間種植率、妊娠率和流產(chǎn)率分別比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表4)。

表4 相同質(zhì)量來(lái)源不同的囊胚解凍移植的臨床妊娠結(jié)局比較

3 討論

3.1 結(jié)果分析

新鮮周期中,形態(tài)學(xué)評(píng)分低的D3胚胎有一定形成囊胚的能力,并且形成非優(yōu)質(zhì)可用囊胚的比例較高,說(shuō)明D3胚胎形態(tài)級(jí)別雖然低,但是仍然有一部分胚胎具有發(fā)育的潛力。

在囊胚解凍移植周期中,D3高評(píng)分胚胎形成的優(yōu)質(zhì)囊胚移植比例較高,而D3低評(píng)分胚胎形成的非優(yōu)質(zhì)可用囊胚移植比例較高,這與新鮮周期D3低評(píng)分胚胎形成非優(yōu)質(zhì)可用囊胚比例較高有關(guān)系。分析對(duì)比三組的基本臨床信息,發(fā)現(xiàn)患者的年齡在三組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);平均移植胚胎數(shù)在三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),這是因?yàn)槟遗呙看我浦矓?shù)通常控制在1枚,而D3優(yōu)質(zhì)胚胎移植2枚的周期較多。三組間種植率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),移植的囊胚組優(yōu)于D3優(yōu)質(zhì)胚胎組,但囊胚組兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.324);造成這個(gè)結(jié)果的原因,其一可能是D3高評(píng)分胚胎形成的囊胚組的患者年齡偏低;其二是囊胚本身的種植率優(yōu)于D3優(yōu)質(zhì)胚胎,所以D3低評(píng)分胚胎形成的囊胚依然有較高的種植率。三組間臨床妊娠率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039),D3高評(píng)分胚胎形成的囊胚組高于D3優(yōu)質(zhì)胚胎組(P=0.024),D3低評(píng)分胚胎形成的囊胚組高于D3優(yōu)質(zhì)胚胎組(P=0.150)但低于D3高評(píng)分胚胎形成的囊胚組(P=0.480)。三組間流產(chǎn)率和生化妊娠率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？偨Y(jié)上述結(jié)果一方面證明解凍移植周期中,D3低評(píng)分胚胎形成的囊胚有很好的利用價(jià)值,有較高的種植率和妊娠率;另一方面,當(dāng)患者解凍移植周期有對(duì)應(yīng)上述三組胚胎/囊胚供選擇時(shí),D3高評(píng)分胚胎形成的囊胚最優(yōu),D3低評(píng)分胚胎形成的囊胚其次,最后選擇移植D3優(yōu)質(zhì)胚胎。

對(duì)于解凍移植囊胚時(shí),囊胚評(píng)分級(jí)別相同、D3評(píng)分不同的囊胚妊娠結(jié)局對(duì)比,種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。目前數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),囊胚期的評(píng)分級(jí)別相同,解凍移植周期的臨床妊娠結(jié)局也是相似的。但是周期數(shù)較少,若要得出上述結(jié)論還需更多周期數(shù)據(jù)的支持?？傊?D3低評(píng)分的胚胎形成的囊胚在不增加流產(chǎn)率的同時(shí)能夠獲得較好的種植率和妊娠率。進(jìn)一步說(shuō)明了D3低評(píng)分的胚胎形成的囊胚仍有較好的利用價(jià)值。

3.2 D3低評(píng)分的胚胎形成囊胚后解凍移植的意義

目前大部分中心都是利用胚胎的形態(tài)學(xué)來(lái)評(píng)定胚胎是否優(yōu)質(zhì),D3胚胎在評(píng)定之后,新鮮周期選擇冷凍或者移植;而剩余的評(píng)分低胚胎會(huì)選擇繼續(xù)體外培養(yǎng),并且在許多文章中都報(bào)道獲得了較好臨床妊娠結(jié)局[9-13]。首先,胚胎在體外培養(yǎng)至囊胚期時(shí),會(huì)將一些發(fā)育潛力弱,染色體異常的胚胎淘汰;其次,囊胚是胚胎發(fā)育的高級(jí)階段,在自然生理狀態(tài)下,胚胎早期在輸卵管發(fā)育,當(dāng)發(fā)育至囊胚階段時(shí)移動(dòng)到子宮腔內(nèi),所以囊胚期的胚胎與子宮內(nèi)膜更同步,增加了囊胚移植的種植率和妊娠率[14]。

本研究通過(guò)對(duì)比D3不同評(píng)分胚胎形成囊胚的情況,發(fā)現(xiàn)評(píng)分低的胚胎仍有一定形成囊胚的能力,并且種植率和妊娠率都高于解凍移植D3高評(píng)分胚胎的周期。另外,D3不同評(píng)分胚胎形成的囊胚,在解凍移植后有較好的妊娠率和較低的流產(chǎn)率。表明了D3低評(píng)分的胚胎具有一定的發(fā)育潛能,所以囊胚培養(yǎng)保證了新鮮周期所有胚胎的充分利用;在解凍移植周期同時(shí)存在D3優(yōu)質(zhì)胚胎和囊胚的情況下,低評(píng)分的胚胎形成的囊胚可以優(yōu)于D3優(yōu)質(zhì)胚胎使用。