雷超，劉聰，劉亭，劉志華

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣州510700

隨著生活水平的提高，不良飲食習(xí)慣作為多種疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素而逐漸受到關(guān)注，其中高鹽飲食被公認(rèn)為是高血壓、心臟病等心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。高鹽飲食指每日飲食中超過(guò)6 g 的鈉鹽攝入量，除食用鹽外還包括醬油、味精等調(diào)味品。近年來(lái)少數(shù)基礎(chǔ)研究提出，高鹽飲食還可能影響認(rèn)知功能，但其具體作用機(jī)制尚不明確［1］。研究顯示，菌—腦軸在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)生理功能方面發(fā)揮重要作用［2］。臨床研究顯示，與健康人群相比，患有認(rèn)知功能受損性疾病的患者，如阿爾茨海默病、精神分裂癥，常表現(xiàn)出特征性的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變。突觸素（SYP）是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的膜蛋白，是突觸發(fā)生和突觸可塑性的重要標(biāo)志，而突觸丟失及功能異常與腦的高級(jí)功能，如學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能受損等有關(guān)。2019 年 10 月－2020 年 5 月，本研究觀察了高鹽飲食對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響，并探討其機(jī)制是否與腸道菌群紊亂有關(guān)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠20只，5周齡，體質(zhì)量約20 g，均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)期間動(dòng)物房室溫維持（22±2）℃，保持每天12 h光照并進(jìn)行通風(fēng)。主要試劑：老鼠普通維持飼料（0.2% NaCl）和高鹽飼料（8% NaCl）均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，RNA抽提、cDNA 合成試劑盒及PCR 反應(yīng)體系均購(gòu)自日本TaKaRa公司，PCR引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 動(dòng)物分組及處理方法 將20 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為正常飲食組和高鹽飲食組，每組10只。正常飲食組給予普通維持飼料喂養(yǎng)，高鹽飲食組給予高鹽飼料喂養(yǎng)，兩組均喂養(yǎng)16周。

1.3 小鼠認(rèn)知功能觀察

1.3.1 偏愛(ài)率 采用新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前3 d，每天依次將小鼠放入長(zhǎng)、寬、高均為50 cm 的黑色塑料箱中，讓其在里面適應(yīng)15 min 后取出。第4天正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，室溫保持25 ℃，用乙醇均勻噴灑箱壁后擦干以清除氣味；在距側(cè)壁15 cm 處平行放入兩個(gè)相同顏色和大小的長(zhǎng)方體，在對(duì)側(cè)放入小鼠，讓其在箱內(nèi)探索8 min 后取出；20 min 后，用乙醇噴灑箱壁后擦干，用圓柱體取代其中的一個(gè)長(zhǎng)方體，放入小鼠讓其探索5 min，記錄小鼠探索兩個(gè)物體的總時(shí)間以及探索圓柱體的時(shí)間，探索時(shí)間為小鼠使用鼻子或嘴巴、前爪接觸或距離物體2～3 cm 的時(shí)間。偏愛(ài)率=探索圓柱體的時(shí)間/探索兩個(gè)物體的總時(shí)間×100%。

1.3.2 自發(fā)反應(yīng)交替率 采用Y 迷宮實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)使用的Y 迷宮有三臂，各臂夾角均為120 ℃，每一臂尺寸均為40 cm×10 cm×15 cm，在迷宮各個(gè)臂內(nèi)貼上不同的幾何圖形，作為視覺(jué)標(biāo)記。將小鼠放在一個(gè)臂的末端，記錄8 min 內(nèi)小鼠進(jìn)入各個(gè)臂的順序，并在結(jié)束時(shí)噴灑乙醇，充分消除殘留的氣味。自發(fā)性交替反應(yīng)被定義為連續(xù)進(jìn)入3 個(gè)臂，如1、2、3 或1、3、2。自發(fā)反應(yīng)交替率=實(shí)際自發(fā)交替反應(yīng)次數(shù)/（進(jìn)臂總次數(shù)-2）×100%。

1.4 糞便腸道菌群差異性檢測(cè) 采用高通量測(cè)序法進(jìn)行16S rDNA 基因V4 片段的基因測(cè)序。收集兩組小鼠的新鮮大便，將樣品（＞0.5 g）置于標(biāo)準(zhǔn)冷凍管中，立即置于液氮保存，樣本檢測(cè)由北京百邁客生物科技有限公司完成。首先對(duì)送檢DNA 樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后的樣品構(gòu)建文庫(kù)；回收目的擴(kuò)增片段，用 T4 DNA 聚合酶、Klenow DNA 聚合酶和 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK），將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端，再通過(guò)3'端加堿基腺嘌呤（A），使得DNA 片段能與3'端帶有堿基胸腺嘧啶（T）的特殊接頭連接；或者設(shè)計(jì)合成含有測(cè)序接頭的雙索引序列融合引物，以基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，利用磁珠法篩選目的擴(kuò)增片段，最后用合格的文庫(kù)進(jìn)行DNA 簇（DNA cluster）制備和測(cè)序。采用Mothur（version v.1.30）軟件分析OUT 和α 多樣性；OTU 即分類操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系、種、屬、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志，本研究采用序列之間的97%相似性把某一個(gè)分類單元定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一種代表序列；α多樣性指標(biāo)包括 Chao1、Ace、Shannon 和 Simpson。采用Metastats軟件比較兩組門水平和種水平上的菌群相對(duì)豐度。

1.5 腦組織SYP mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后處死，取出腦組織，用生理鹽水仔細(xì)清洗表面血跡。使用TRIzol 試劑盒提取腦組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。PCR 反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，之后95 ℃持續(xù)40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)15 s，60 ℃ 1 min。引物序列：SYP上游引物 5′-TGGAGTGTGCCAACAAGACG-3′、下游引物5′-CAAACACAGCCACGGTGACAA-3′，內(nèi)參β-actin 上游引物 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′、下游引物 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。所有反應(yīng)設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SYP mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠認(rèn)知功能相關(guān)指標(biāo)比較 高鹽飲食組小鼠偏愛(ài)率、自發(fā)反應(yīng)交替率分別為62.4% ±2.4%、57.2% ± 3.0%，正常飲食組分別為72.0% ±3.1%、69.1% ±2.3%，兩組比較P均＜0.05。

2.2 兩組小鼠糞便腸道菌群構(gòu)成比較 高鹽飲食組小鼠糞便菌群OUT 為168.0 ± 11.7，正常飲食組為155.4 ± 12.7，兩組比較P＞0.05。高鹽飲食組小鼠糞便菌群 α 多樣性指標(biāo) Ace、Chao1、Shannon、Simpson 分 別 為 196.1 ± 7.3、179.1 ± 8.2、3.0 ±0.1、0.120 ± 0.010，正常飲食組分別為 181.2 ±9.9、174.5±9.3、3.1±0.2、0.100±0.007，兩組比較P均＞0.05。門水平：高鹽飲食組小鼠糞便菌群中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）的相 對(duì) 豐 度 分 別 為 49.29% ± 12.73%、35.26% ±14.31%、6.42% ± 7.11%、0.45% ± 0.17%，正常飲食組分別為41.25% ± 13.20%、48.28% ± 8.73%、6.29% ± 4.47%、0.26% ± 0.19%，兩組比較P均＞0.05（OSID 碼圖1）。種水平：高鹽飲食組小鼠糞便菌群中嗜黏蛋白艾克曼菌（A.muciniphila）、產(chǎn)酸芽孢桿菌（B.acidifaciens）、柔嫩梭菌菌（C.leptum）、嚙齒動(dòng)物糞桿菌（F. rodentium）相對(duì)豐度分別為7.024% ± 0.461%、0.243% ± 0.037%、0.047% ±0.028%、1.292% ± 0.145%，正常飲食組分別為2.113% ± 0.023%、0.033% ± 0.002%、0.213% ±0.048%、0.023%±0.003%，兩組比較P均＜0.05。

2.3 兩組小鼠腦組織SYP mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 高鹽飲食組與正常飲食組小鼠腦組織SYP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.811 2±0.039 0、1.000 0±0.054 6，兩組比較P＜0.05。

3 討論

認(rèn)知功能是腦的重要功能之一，主要指學(xué)習(xí)與記憶能力。研究表明，認(rèn)知功能障礙相關(guān)性疾病患者大多出現(xiàn)具有特征性的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，說(shuō)明腸道菌群與認(rèn)知功能受損可能有關(guān)［3］。腸道菌群主要存在于結(jié)腸，種類估算有1千種以上，主要分為四大菌門：Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria，不同種類細(xì)菌的數(shù)量維持動(dòng)態(tài)平衡，可作為整體參與食物消化吸收、維持腸上皮屏障功能、調(diào)節(jié)免疫等機(jī)體生理活動(dòng)［4］。腸道菌群的結(jié)構(gòu)、多樣性變化時(shí)，可不同程度地影響宿主的生理功能，或可導(dǎo)致病理改變。近年來(lái)腸道菌群與全身多系統(tǒng)相互作用的機(jī)制陸續(xù)被提出，如腸道菌群—腸—肝軸、腸道菌群—腸—肺軸以及本文研究的腸道菌群—腸—腦軸［5］。既往主流觀點(diǎn)強(qiáng)調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)在腸道菌群—腸—腦軸調(diào)控中占主導(dǎo)地位，隨著菌群測(cè)序技術(shù)的成熟及糞菌移植方法的流行，越來(lái)越多的研究報(bào)道認(rèn)為腸道菌群在調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能狀態(tài)方面存在不容忽視的作用。因此，本研究探討腸道菌群紊亂與不良飲食習(xí)慣誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損傷的相關(guān)性。

本課題組既往行為學(xué)結(jié)果顯示，普通小鼠認(rèn)知功能存在個(gè)體間差異，為避免抽樣誤差，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用隨機(jī)分組原則；其次兩組小鼠均選取相同的品系，并在相同的環(huán)境中飼養(yǎng)，避免遺傳、環(huán)境等因素對(duì)腸道菌群的影響。與之前的高鹽飲食研究［6］不同的是，我們并未在小鼠飲用水中添加一定濃度的鈉鹽，這能更好地模擬人類的不健康飲食習(xí)慣。Y 迷宮主要用于小鼠辨別性學(xué)習(xí)，工作記憶和參考記憶的測(cè)試；新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)可用于非空間記憶的測(cè)試。這兩種方法具有讓小鼠在自由活動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶的特點(diǎn)，能充分反映小鼠的認(rèn)知功能狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，高鹽飲食小鼠的自發(fā)反應(yīng)交替率和偏愛(ài)率均明顯降低，說(shuō)明高鹽飲食降低了小鼠的認(rèn)知功能。此外，高鹽飲食小鼠腦組織SYP mRNA 相對(duì)表達(dá)量下降，而SYP在神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性和突觸發(fā)育等重要生理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［7］。因此，高鹽飲食可能通過(guò)影響神經(jīng)系統(tǒng)突觸相關(guān)生理過(guò)程而損傷小鼠的認(rèn)知功能。

本研究采用OUT 和α 多樣性來(lái)評(píng)估腸道菌群多樣性的變化，α 多樣性有4 種衡量指標(biāo)，分別為Chao1、Ace、Shannon 和 Simpson，結(jié)果顯示兩組OUT和α多樣性指標(biāo)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腸道菌群的構(gòu)成主要由飲食和生活方式?jīng)Q定，遺傳因素的影響很小，由飲食習(xí)慣不同導(dǎo)致的腸道菌群多樣性變化主要表現(xiàn)為食物種類差異，而高鹽飲食未改變飲食中各種營(yíng)養(yǎng)素的占比，對(duì)腸道菌群整體的生存、代謝方式影響較小，故本研究顯示高鹽飲食對(duì)腸道菌群多樣性的影響較小，同時(shí)暗示腸道菌群受到高鹽飲食的影響或許僅局限于少數(shù)有重要意義的菌種上。為了進(jìn)一步探索腸道菌群構(gòu)成的變化，我們首先分析了兩組腸道菌群構(gòu)成在門水平的差異，結(jié)果顯示高鹽飲食組Firmicutes 相對(duì)豐度升高，而Bacteroidetes 相對(duì)豐度降低，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究顯示，腸道菌群結(jié)構(gòu)的這一變化不僅與肥胖、結(jié)腸炎、冠心病等疾病有關(guān)［8］，近年來(lái)也被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如抑郁癥、精神分裂癥、自閉癥等有關(guān)［9］。在種水平上，我們進(jìn)一步找出了四種差異細(xì)菌，分別為A.muciniphila、B.acidifaciens、C.leptum、F.rodentium。A.muciniphila 是2004 年在人體腸道中分離出來(lái)的菌種，在人類消化道中普遍存在，占比3%～5%，補(bǔ)充A. muciniphila 或可延緩衰老，增強(qiáng)抗腫瘤藥物療效［10］。B.acidifaciens 可促進(jìn)結(jié)腸中分泌型 IgA 的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)腸上皮黏膜［11］。這兩種菌群豐度的增加可能來(lái)源于長(zhǎng)期高鹽飲食對(duì)腸道內(nèi)環(huán)境的破壞而引起的代償性保護(hù)反應(yīng)，這一獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)有待未來(lái)深入研究。F. rodentium 與人類疾病相關(guān)的研究甚少。C.leptum 是一種產(chǎn)丁酸鹽菌，而丁酸鹽被發(fā)現(xiàn)可抑制帕金森病模型小鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及組蛋白乙?；?，從而改善認(rèn)知功能；其次，丁酸作為短鏈脂肪酸之一，亦有助于抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能［12］。結(jié)合在門水平上Firmicutes 豐度增加及Bacteroidetes 豐度減少與機(jī)體促炎細(xì)胞因子的增多相關(guān)，而腦組織慢性微炎癥狀態(tài)與認(rèn)知功能下降相關(guān)。因此，我們推測(cè)高鹽飲食可損傷小鼠的認(rèn)知功能，可能主要與促炎相關(guān)的腸道菌群失調(diào)及少數(shù)幾種細(xì)菌相對(duì)豐度改變有關(guān)，尤其是與產(chǎn)丁酸鹽菌C.leptum 的減少相關(guān)，但其因果關(guān)系驗(yàn)證尚需糞菌移植等菌群干預(yù)措施進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，高鹽飲食可損傷小鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與腸道菌群紊亂有關(guān)。雖然許多關(guān)于腸道菌群—腸—腦軸參與飲食模式調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的研究均強(qiáng)調(diào)腸道菌群應(yīng)作為一個(gè)整體發(fā)揮效應(yīng)，但本研究認(rèn)為高鹽飲食對(duì)腸道菌群的影響應(yīng)著重于驗(yàn)證少數(shù)受到影響的細(xì)菌，高鹽飲食與C.leptum 減少的相關(guān)性有待在更大樣本量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，以及C.leptum 是否是高鹽飲食損傷認(rèn)知功能的關(guān)鍵介質(zhì)仍有待確定。