龔振翔，丁鳳菲，巴黎，溫咪咪，唐嘉蕙，黃麗芳，李澤慧，楊園，張旻

肌萎縮側(cè)索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種累及大腦皮質(zhì)、腦干及脊髓前角上下運動神經(jīng)元的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)為腱反射亢進、病理征等錐體束征及進行性加重的肌肉萎縮、無力，最終將導(dǎo)致吞咽困難和呼吸無力，大部分患者確診3～5年內(nèi)死于嚴(yán)重的肺部感染[1]。ALS的發(fā)生和發(fā)展被認(rèn)為是風(fēng)險遺傳背景存在前提下，環(huán)境風(fēng)險因素和機體老化共同作用的結(jié)果[2]，但具體發(fā)病機制尚未明確。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于ALS 治療的藥物僅有利魯唑和依達拉奉[3]，探索病理機制仍是尋找ALS 治療方法的關(guān)鍵一步。近年來，腸道菌群研究成為神經(jīng)系統(tǒng)變性病的熱點。本文全面回顧了近年來有關(guān)ALS 腸道菌群的動物研究和臨床研究，創(chuàng)新性地從腸道菌群對于ALS可能的致病和治療機制綜合討論，旨在探索ALS病理機制新方向、尋找ALS潛在治療靶點。

1 腸道菌群

人體遠(yuǎn)端結(jié)腸及直腸中有大約10 萬億至100萬億微生物，其中95%以上是細(xì)菌，這些細(xì)菌的遺傳物質(zhì)遠(yuǎn)超人類基因組[4]。在基因測序技術(shù)問世以前，人類對細(xì)菌的研究方法僅限于成功分離培養(yǎng)后進行形態(tài)學(xué)觀察和藥物測試等。然而受制于分離技術(shù)和培養(yǎng)條件，人類僅能分離并培養(yǎng)很少一部分細(xì)菌?；驕y序技術(shù)的出現(xiàn)和革新，尤其是高通量的二代測序技術(shù)使得細(xì)菌研究實現(xiàn)質(zhì)的飛躍[5]。Carl Woese 教授開創(chuàng)性地使用了16S rDNA 對細(xì)菌進行分類，即擴增子測序分類技術(shù)。16S rDNA 是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA（細(xì)菌核糖體成分之一）相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，其長度適合測序，進化具有高度的保守性。利用擴增子測序，可實現(xiàn)短時間內(nèi)對細(xì)菌種類及功能的鑒定[6]。這使得細(xì)菌與疾病的研究不再局限于少數(shù)感染性疾病，細(xì)菌與眾多其他疾病的關(guān)系逐漸被揭示。

2 腸道菌群與ALS

腸道內(nèi)的細(xì)菌作為人體微生態(tài)環(huán)境的主要構(gòu)成部分，與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。有關(guān)腸道菌群異常與疾病的研究始于腸道疾病，如腸易激綜合征、炎癥性腸病等都被證實與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。甚至有些疾病與腸道菌群的研究已從基礎(chǔ)研究過渡至臨床治療，糞便移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）在難治性潰瘍性結(jié)腸炎的治療中已取得顯著療效[7]。在非消化系統(tǒng)疾病的研究中，神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病已成為熱點，原因在于腸道作為一個消化器官卻擁有和顱內(nèi)同樣數(shù)目的神經(jīng)元，迷走神經(jīng)從腦干發(fā)出后一直延伸至腹腔成為終末支[8]。大量臨床研究證實阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森病患者存在腸道菌群失調(diào)[9]，淀粉樣蛋白和α突觸核蛋白都被發(fā)現(xiàn)存在于腸道神經(jīng)中。由于發(fā)病率低和生存周期短等原因，同為神經(jīng)系統(tǒng)變性病的ALS受到的關(guān)注不如前兩者多，但目前的研究肯定了在ALS 發(fā)病過程中，存在腸道菌群失調(diào)及細(xì)菌相關(guān)代謝、免疫等方面的異常。

2.1 ALS腸道菌群組成異常

想要清楚腸道菌群在ALS中扮演的角色，首先要明確ALS 患者腸道菌群組成在數(shù)量上的變化。目前已發(fā)表的關(guān)于ALS 腸道菌群組成的臨床研究有以下幾個。

安丙辰等[10]的研究納入8例ALS患者和8例對照者，結(jié)果顯示與對照組相比，ALS 患者腸道菌群的α多樣性升高。在不同分類水平各種細(xì)菌的相對豐度比較中，患者組和對照組都以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）占絕對優(yōu)勢。在門水平，患者組厚壁菌門增多，擬桿菌門和變形菌門減少；在綱水平，患者組革蘭氏陰性菌綱（Negativicutes）和芽孢桿菌綱（Bacillibacteria）增多；而在屬水平，患者組甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）增多，糞桿菌屬（Faecalibacterium）和擬桿菌屬（Bacteroides）減少。腹腔疾病、腸易激綜合癥及哮喘常伴糞桿菌屬的減少，因此糞桿菌屬通常被認(rèn)為是有益菌。而甲烷短桿菌屬可消耗短鏈脂肪酸產(chǎn)生甲烷氣體，產(chǎn)甲烷的細(xì)菌增多常伴隨體重減輕，甲烷短桿菌屬被認(rèn)為是有害菌?？傮w來看，此研究中ALS腸道菌群構(gòu)成與對照不同，某些有利健康的細(xì)菌減少，有害健康的細(xì)菌增多。

方鑫等[11]研究納入6 例ALS 患者和5 例對照者，結(jié)果顯示ALS 患者的腸道菌群物種豐富度高于對照組，2 組β多樣性（反映菌群的整體構(gòu)成）也明顯不同。在相對豐度比較中，在門水平，患者組厚壁菌門減少，擬桿菌門增多；在屬水平，患者組毛螺菌屬（Lachnospira）、顫桿菌屬（Oscillibacter）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）減少，Dorea 增多。Dorea 消耗葡萄糖后的終產(chǎn)物為乙醇，對機體可造成損害，而雙歧桿菌屬、毛螺菌屬都可以產(chǎn)生對腸道穩(wěn)態(tài)有益的短鏈脂肪酸。厚壁菌門與擬桿菌門的比值（F/B）是腸道健康狀態(tài)的一個指標(biāo)，過高或過低的F/B都提示腸道菌群失穩(wěn)態(tài)。

Rowin 等[12]的研究納入5 例ALS 患者，并使用一個健康者腸道菌群樣本庫作對照。在相對豐度比較中，5例患者中有3例F/B 過低，而1 例正使用益生菌補充制劑的患者則沒有這種變化。

Brenner 等[13]的研究納入 25 例 ALS 患者和 32 例對照者，對所有受試者的糞便進行16s RNA測序，結(jié)果顯示ALS患者腸道菌群分類單元數(shù)目多于對照組，但2 組之間腸道菌群在α多樣性、β多樣性方面并無明顯差異，在不同分類學(xué)水平的各種細(xì)菌相對豐度比較中也僅有瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的相對豐度不同。

F/B 的比值作為已知的衡量腸道菌群健康狀況的重要指標(biāo)[14]，在現(xiàn)有的ALS 患者研究中均顯示出異常，同時ALS 患者中有益細(xì)菌的減少以及有害細(xì)菌的增多，也提示ALS患者的腸道菌群失調(diào)。但由于納入研究的ALS患者的異質(zhì)性、測序技術(shù)（如使用的引物）等不同，部分研究結(jié)果不一致，這也是當(dāng)前ALS腸道菌群臨床研究的不足之處。隨著大樣本、高質(zhì)量研究的開展，ALS患者腸道菌群改變的共性特點必將被揭示。

2.2 ALS腸道菌群與腸道功能異常

已有研究利用放射性核素和放射性不透明物證實ALS 患者存在腸道功能異常，包括胃排空延遲、結(jié)腸轉(zhuǎn)運延遲和肛門括約肌異常，這些可能是導(dǎo)致部分ALS患者出現(xiàn)便秘癥狀的生理機制[15]。由腸道上皮細(xì)胞緊密連接和黏附連接構(gòu)成的頂端連接復(fù)合體是維持腸道完整性的選擇性屏障，具有防止病原微生物通過的重要功能。ALS模型小鼠（G93A）與野生型小鼠相比，在未表現(xiàn)出運動癥狀之前，其腸道菌群構(gòu)成已出現(xiàn)異常，溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio Fibrisolvens）和大腸桿菌（E.coli）顯著減少，溶纖維丁酸弧菌對維持腸道上皮完整性至關(guān)重要。同時，ALS模型小鼠腸道潘氏細(xì)胞的數(shù)目減少且形態(tài)異常，潘氏細(xì)胞分泌的5α抗菌肽也減少，且腸道上皮緊密連接蛋白ZO-1和鈣粘蛋白的表達也明顯減少。使用熒光素對小鼠進行灌胃處理后，G93A小鼠血液中可檢測到的熒光素較野生型小鼠增多2倍[16]。以上實驗說明在ALS的病理過程中，腸道結(jié)構(gòu)和生理功能的損害可能與某些細(xì)菌有關(guān)，腸道菌群失調(diào)和生理功能異常都早于ALS臨床癥狀出現(xiàn)。

2.3 ALS腸道菌群與代謝異常

部分合并認(rèn)知功能障礙的ALS 患者可能出現(xiàn)飲食偏好改變，傾向于攝入含飽和脂肪酸多、熱量更高的食物，從而導(dǎo)致體重短暫性升高[17]。但總體來看，隨著病程的進展，患者體重會進行性下降。疾病后期的體重下降可能是由于咽喉部肌肉受累導(dǎo)致的進食困難，但是相當(dāng)一部分患者從疾病確診開始體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）就持續(xù)性下降[18]。通過間接熱量測定法，研究人員證實約半數(shù)的ALS患者會出現(xiàn)靜息態(tài)能量消耗升高（resting energy expenditure，REE），這種改變在家族型ALS中更為常見。REE 患者往往疾病進展更快，生存期更短[19]。腸道菌群與能量代謝密不可分，高BMI與低BMI的患者擁有不同的腸道菌群分型，一個關(guān)于肥胖人群的研究指出，厚壁菌門少而擬桿菌門多的人往往擁有更高的靜息態(tài)能量消耗[20]。ALS患者能量代謝的異常也可能與某些特定腸道菌群的改變有關(guān)，安丙辰等的研究發(fā)現(xiàn)ALS 患者糞便內(nèi)廣古菌門中的甲烷桿菌屬相對豐度明顯升高，產(chǎn)甲烷的細(xì)菌是一類可以消耗大量碳水化合物生成甲烷氣體的古細(xì)菌，這可能是ALS患者基礎(chǔ)代謝率升高和體重減輕的原因之一。

膳食纖維是一類不能被腸道內(nèi)的酶分解的物質(zhì)，攝入后基本以完整的形式到達結(jié)腸，曾被認(rèn)為是“無營養(yǎng)物質(zhì)”。然而隨著營養(yǎng)學(xué)發(fā)展，膳食纖維被證實是某些腸道菌群的主要“食物”，比如普雷沃氏菌屬[21]。膳食纖維在腸道菌群的參與下，在結(jié)腸內(nèi)經(jīng)發(fā)酵過程可以產(chǎn)生一類被稱為“短鏈脂肪酸”的物質(zhì)，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸等[21]。短鏈脂肪酸對維持腸道上皮完整性，抵抗病原微生物入侵起著重要作用。在人體研究中，Rowin等測定5例ALS患者糞便中的短鏈脂肪酸濃度，其中2例患者的短鏈脂肪酸減少。

除能量代謝和短鏈脂肪酸代謝外，γ氨基丁酸、亞硝酸鹽、內(nèi)毒素等都是ALS有關(guān)腸道菌群代謝產(chǎn)物[22]。這些代謝物大多是對人體有害的物質(zhì)，因此代謝紊亂是腸道菌群重要的致病途徑。

2.4 ALS腸道菌群與免疫異常

尸檢證實ALS患者皮質(zhì)脊髓束、前角和中央前回都有淋巴細(xì)胞浸潤，大多數(shù)是CD8+的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，混合著巨噬細(xì)胞和CD4+輔助T 細(xì)胞[23]。ALS 患者血清和腦脊液中的白細(xì)胞介素17（IL-17）和白細(xì)胞介素23（IL-23）均較非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病明顯升高[24]。IL-17 由Th17 細(xì)胞產(chǎn)生，是破壞自身免疫的重要免疫因子[25]。IL-23由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，具有輔助Th17細(xì)胞持續(xù)分泌IL-17的作用[26]。腸道內(nèi)分布著大量腸道相關(guān)的淋巴樣組織，大致可分兩類，一類是以派氏淋巴結(jié)為代表的組織樣淋巴組織，另一類是散在分布在腸壁中的淋巴細(xì)胞[27]。從出生起，腸道內(nèi)的免疫細(xì)胞和腸道菌群相互作用，誘導(dǎo)口服免疫耐受，建立對病原微生物的識別系統(tǒng)。腸道菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)遭到破壞，免疫系統(tǒng)必然出現(xiàn)異常，腸菌失調(diào)可能是ALS 免疫異常的原因之一。前文已述ALS 患者腸內(nèi)短鏈脂肪酸的生成減少，而丁酸鹽具有抑制促炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，進而改善腸道上皮屏障功能并對抗腸道炎癥的作用[28]。潘氏細(xì)胞是小腸內(nèi)一種調(diào)節(jié)自噬活性和宿主-細(xì)菌的相互作用的特殊上皮細(xì)胞，富含溶菌酶并分泌抗菌肽，功能類似于中性粒細(xì)胞，丁酸鹽可以維持潘氏細(xì)胞正常形態(tài)和功能[14]。腸道菌群異常的G93A小鼠血清中的IL-17 濃度升高，這種腸道菌群和免疫因子水平異常的關(guān)聯(lián)不僅局限于動物模型。Rowin 等發(fā)現(xiàn)，ALS 患者腸道菌群失調(diào)的同時,糞便中的炎性標(biāo)志物（糞便分泌性IgA、鈣網(wǎng)蛋白、嗜酸性蛋白X）升高。AD患者的尸檢已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌碎片和顱內(nèi)淀粉樣斑塊存在共定位關(guān)系，促炎因子也與AD 患者的認(rèn)知障礙有關(guān)[29,30]。ALS同為神經(jīng)系統(tǒng)變性病，有足夠的理由推測腸道菌群異常導(dǎo)致的腸道免疫異?？赡艽龠M激活的T細(xì)胞甚至是細(xì)菌進入血液后穿過血腦屏障，進一步激活膠質(zhì)細(xì)胞，最終完成從腸道到大腦的病理遷徙。

3 腸道菌群與ALS治療

調(diào)節(jié)腸道菌群，促使腸道菌群向有益健康的方向改變是一個復(fù)雜的過程，目前已有的方法主要包括飲食調(diào)整、補充益生菌和益生元、FMT。顧名思義，飲食調(diào)整和口服補充益生菌制劑容易實施，而FMT較為復(fù)雜。FMT是將提前制備好的菌株接種至患者結(jié)腸特定部位，人為調(diào)控腸道菌群穩(wěn)態(tài)建立。微生態(tài)療法對于ALS 患者來說，可能通過修復(fù)受損的腸道上皮屏障、調(diào)節(jié)免疫和降低體循環(huán)中炎癥因子水平等途徑延緩ALS 病程加重。

動物實驗中，G93A 小鼠的飲食中添加丁酸鹽后其生存周期平均延長38 d，腸道上皮緊密連接蛋白ZO-1和鈣粘蛋白表達增多，潘氏細(xì)胞的形態(tài)趨于正常化。在體外培養(yǎng)時加入丁酸鹽處理，ALS-SOD1 基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的人類腸道上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)聚集體明顯減少[14]。以地中海飲食為代表的健康飲食方式可以提供更多的腸道菌群代謝底物并改變腸菌構(gòu)成比例，從而提高腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的濃度，這對于ALS等存在腸道上皮屏障功能受損的神經(jīng)退行性疾病可能是有效的?？诜a充雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌混合制劑，在年齡相關(guān)模型小鼠中可以調(diào)節(jié)顱內(nèi)組織免疫相關(guān)基因表達，減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活并增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子[31]。在胰島素抵抗和AD 模型小鼠中，補充益生菌制劑可以減少體循環(huán)中的促炎因子，包括趨化因子1、白介素6、γ干擾素和腫瘤壞死因子α等[32,33]。腸道菌群通過調(diào)節(jié)免疫、降低炎癥治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的機制尚未闡明，目前還處于起步階段。

在神經(jīng)退行性疾病的人體臨床研究中，帕金森病患者口服益生菌制劑有助于改善神經(jīng)源性便秘，輕度認(rèn)知功能障礙的患者補充益生菌24 周后其認(rèn)知功能得到改善[34]。鑒于ALS 發(fā)病率較低、口服益生菌制劑和FMT臨床研究的安全性和研究倫理等方面的原因，目前ALS領(lǐng)域尚無已發(fā)表的以腸道菌群為治療靶點的臨床研究。臨床實驗注冊網(wǎng)站上有一項編號為NCT03324399 的針對ALS 的小型益生菌口服試驗正在進行。此外，也有一項編號為NCT0376632的針對ALS患者的FMT隨機雙盲對照實驗正在進行[35]。

4 總結(jié)與展望

目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸道菌群在ALS 病理過程中扮演重要角色，腸道菌群失調(diào)造成ALS 相關(guān)代謝、免疫、神經(jīng)分泌異常，即腦-腸-微生物軸的異常運轉(zhuǎn)，提示腸道菌群是有可能成為潛在的ALS治療靶點。

腸道菌群給探索ALS發(fā)病機制、尋找新的治療方法帶來了希望，但目前的研究也有很多不足之處。一方面，在動物實驗中用于研究的小鼠在飲食、生活環(huán)境等方面的異質(zhì)性較小，而世界各地不同人群在飲食、文化、作息等方面差異很大，飲食等是影響腸道菌群的重要因素。小鼠與人類的物種差異本身也決定了腸道菌群構(gòu)成上的區(qū)別，對于小鼠腸道菌群的研究結(jié)果很可能并不適用于人體。另一方面，目前ALS腸道菌群臨床研究基本只是對患者的腸道菌群進行16S rDNA測序。擴增子測序?qū)δc道菌群組成僅能部分描述，且對功能的描述只能依靠算法進行預(yù)測，尚未實現(xiàn)對真實功能的測定。腸道菌群失調(diào)對疾病的影響是蛋白質(zhì)水平的，單是基因?qū)用娴呢S度區(qū)別不足以揭示細(xì)菌的致病作用。除此之外，ALS 是一個進展性疾病，目前尚缺乏對腸道菌群的縱向隊列研究。

未來對于ALS與腸道菌群的研究應(yīng)注意以下三點：①ALS的診斷目前仍依賴于肌電圖和臨床表現(xiàn)，尚缺乏特異性的生物標(biāo)記物[36]。早期診斷對于改善ALS患者生存質(zhì)量至關(guān)重要。因此，在缺乏新的有效藥物的情況下，是否有某些特定的細(xì)菌、不同細(xì)菌的構(gòu)成比或是細(xì)菌代謝產(chǎn)物可以作為診斷ALS 的早期生物標(biāo)記物值得深入探索。②由于不同人群的異質(zhì)性，多中心合作的大型ALS患者腸道菌群隊列研究顯得尤為必要[37]。只有在不同人群中尋找共同點，并探索隨著病程進展ALS患者腸道菌群變化的特點，才可能明確腸道菌群的基本致病機制，早日實現(xiàn)研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。③多組學(xué)研究是一種把基因組、表觀遺傳組、蛋白組、代謝組等結(jié)合起來的疾病研究方法[38]，對于ALS腸道菌群研究來說，僅僅依賴宏基因組水平的分類學(xué)研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，從多方面、多角度進行探索是疾病研究的必經(jīng)之路。

ALS 作為一種發(fā)病率有上升趨勢的疾病，對患者、患者家庭及社會造成了巨大影響，冰桶挑戰(zhàn)也讓人們越來越了解“漸凍癥”群體。腸道菌群研究不論是在ALS還是其他疾病中都剛起步，相信隨著研究的不斷深入，在不久的將來這一領(lǐng)域?qū)⑷〉脛萑缙浦竦耐黄啤?/p>