鮑 紅，楊力俠，高 敏*

(1.西電集團(tuán)醫(yī)院，陜西西安710077；2.西安外事學(xué)院，陜西西安710077)

膠質(zhì)瘤(Gliomas)起源于神經(jīng)上皮，由于血管豐富，生長快，易受正常腦組織侵犯，臨床預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率高，對放療、化療耐藥，仍是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-3]。加之膠質(zhì)瘤的發(fā)生具有復(fù)雜的生物學(xué)特性，涉及一系列的病理生理變化，以及多種基因和信號通路的表達(dá)變化，使得膠質(zhì)瘤的臨床治療效果較差[2-4]。目前對于介導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子機(jī)制還沒有明確的結(jié)論。因此迫切需要探索新的治療靶點(diǎn)成功干預(yù)膠質(zhì)瘤。

長鏈非編碼RNA(longnon-coding RNAs,LNCRNAs)[5-9]是ncRNA家族的一員，其長度超過200個核苷酸，具有較低的小分子多肽編碼能力。越來越多的研究表明，lncRNA在人類癌癥中起著重要的作用，包括肝癌(HCC)[6]、膠質(zhì)瘤[7]等。異常的lncRNAs廣泛參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤發(fā)生，調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[5-9]。lncRNAs不僅可以作為膠質(zhì)瘤診斷的重要標(biāo)志物，而且可作為膠質(zhì)瘤患者重要的預(yù)后指標(biāo)[7-9]。

LncRNA長基因間非蛋白編碼RNA0116(LINC01116)，位于2號染色體，其在乳腺癌[10]，骨肉瘤[11]、前列腺癌[12]等中已有報道，對多種癌癥的生物學(xué)過程具有積極的影響，尤其在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等方面[10-14]。然而，LINC01116在膠質(zhì)瘤中的作用還有待探索。本研究旨在探討LINC01116在膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中的表達(dá)增殖、侵襲與遷移，及可能存在的調(diào)控機(jī)制，為腦膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG、U251、A172購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)，正常的人類星形細(xì)胞(NHAs)為本實(shí)驗室保存。細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640(hyclone)+0.1%青霉素/鏈霉素+10%胎牛血清(FBS)(Gibco)的培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上用于后續(xù)實(shí)驗，根據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)試劑細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。has-miR-4693-3P minics購自generalbiol公司，LINC01116干擾質(zhì)粒sh-LINC01116、LINC01116過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-LINC01116、野生型及突變型LINC01116報告基因質(zhì)粒(pmirGLO-LINC01116-WT，mirGLO-LINC01116-MUT)均由實(shí)驗室構(gòu)建。TRIzol試劑(Invitrogen，美國)，PrimeScriptRT試劑盒(Takara，日本)、TURBODNA-freeTMKit(Invitrogen，美國)，SYBR Green PCR Master Mix(Takara，日本)，CCK8試劑盒(APExBIO，美國)，Nucleiez lysis Buffer(sigma，美國)。

表1 基因序列

1.2 熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用TRIzol試劑按照說明書從不同處理的培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA，并使用Prime ScriptTMRT Master Mix的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用SYBR Green PCR Master Mix在ABI7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，GAPDH及U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法比較相對表達(dá)量。所用引物如表2所示。

表2 使用的qRT-PCR引物

1.3 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲試驗

細(xì)胞增殖采用CCK8法[15]進(jìn)行，U251與U87MG細(xì)胞中shRNA轉(zhuǎn)染12 h后，細(xì)胞以每孔2×104個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)時間為0、24、48、72、96h使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK8試劑盒，日本同仁)檢測細(xì)胞增殖，所有的檢測都至少重復(fù)三次。

細(xì)胞遷移實(shí)驗采用細(xì)胞劃痕法測定，先用記號筆在6孔板后用直尺畫線，6孔板中加入約2×105個U251細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后用10 μL槍頭用力均勻的在培養(yǎng)皿中劃痕，加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后拍照比較分析。

侵襲實(shí)驗采用Transwell法進(jìn)行[16]，用康寧Transwell預(yù)涂基質(zhì)凝膠進(jìn)行侵襲試驗。shRNA轉(zhuǎn)染24 h后，取200 μL DMEM的細(xì)胞懸液懸浮3×104個細(xì)胞加入24孔Transwell小室，700 μL DMEM(含有10%FBS)添加24孔板下室。在Transwell系統(tǒng)中37℃孵育24 h后，用棉簽取出膜上表面的細(xì)胞，用4%甲醛固定膜下表面的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫過濾。隨機(jī)選取5個視野中的染色細(xì)胞，在熒光顯微鏡下進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 亞細(xì)胞分離

為了探索LINC01116參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們首先利用RNAlocate分析了LINC01116在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的分布。然后使用sigma的細(xì)胞核裂解緩沖液分離純化細(xì)胞質(zhì)RNA和核RNA，具體參照說明書操作。如前所述，采用qRT-PCR檢測LINC01116在核內(nèi)和胞內(nèi)的表達(dá)，分別以U6及GAPDH為參照。

1.5 雙熒光素酶報告基因檢測

實(shí)驗方法參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行，將HEK-293T細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種密度為104個細(xì)胞左右，第2天將40 nmol/L miR-control或者h(yuǎn)as-miR-4693-3P minic、0.2 μg pmirGLO-LINC01116-WT或pmir-GLO-LINC01116-MUT分別共轉(zhuǎn)染，重復(fù)3個復(fù)孔。48 h后每孔加入1×passive溶解緩沖液50 μL，室溫?fù)u床孵育20 min后分別依次加入30 μL裂解液及100 μL熒光素酶緩沖液，多功能酶標(biāo)儀檢測每個孔中螢火蟲熒光素酶活性值。每孔再次加入10 μL Stop & GLO，多功能酶標(biāo)儀讀取海腎熒光素酶活性值。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值，統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法及生物學(xué)方法

athena-innovation.gr/index.php?r=lncbasev2)和miRDB(http://mirdb.org/)預(yù)測LINC01116可能結(jié)合的目標(biāo)microRNA。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 LIN01116在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)

qPCR實(shí)驗結(jié)果顯示，較之NHA細(xì)胞，LINC01116在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87MG、U251、A172)中顯著升高(見圖1，P<0.01)，這提示LINC01116的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關(guān)。

2.2 LINC01116基因的下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移

在U251、A172、U87MG細(xì)胞中，以sh-NC為陰性對照，轉(zhuǎn)染LINC01116特異性的shRNA(sh-LINC01116)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示LINC01116表達(dá)被shRNA明顯抑制(見圖2A，P<0.01)。CCK-8實(shí)驗顯示，sh-LINC01116可抑制U87MG和U251細(xì)胞的增殖(見圖2B，2C，P<0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗顯示，shRNA處理的U251細(xì)胞遷移能力明顯低于對照組的(見圖2D，P<0.01)，Transwell實(shí)驗結(jié)果顯示，shRNA處理的U251細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(見圖2E，P<0.01)。

2.3 LINC01116基于ceRNA調(diào)控機(jī)制

qPCR鑒定LINC01116在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的分布，結(jié)果表明LINC01116在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，但細(xì)胞質(zhì)中LINC01116的比例遠(yuǎn)高于細(xì)胞核中LINC01116的比例(見圖3A)，因此，LINC01116可能通過在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中作為ceRNA發(fā)揮其促癌作用。miRDB和LncBasev.2預(yù)測LINC01116可能潛在靶向位點(diǎn)miRNA為has-miR-4693-3P(見圖3B)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，has-miR-4693-3P可以降低pmirGLO-LINC001116-WT的熒光素酶活性，但不能改變pmirGLO-LINC001116-MUT的熒光素酶活性(見圖3C，P<0.01)。這表明has-miR-4693-3P可以通過識別特定位點(diǎn)直接與LINC001116結(jié)合。此外，CCK-8法測定has-miR-4693-3P和LINC01116在促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的相互作用，結(jié)果顯示has-miR-4693-3P抑制U251和U87MG細(xì)胞生長，而當(dāng)共轉(zhuǎn)染has-miR-4693-3P和pcDNA3.1-LINC01116，has-miR-4693-3P的生長抑制作用得到逆轉(zhuǎn)(見圖3D，3E，P<0.05)。這些結(jié)果表明，LINC01116通過作為has-miR-4693-3P促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)顱內(nèi)腫瘤，占惡性腦瘤的81%，由于預(yù)后不良，它具有侵襲性[1，3]。成像是診斷膠質(zhì)瘤的有效方法[17]，而分子治療仍是膠質(zhì)瘤的主要治療方法[18]。本研究主要探討膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的新分子途徑。越來越多的證據(jù)表明，長鏈非編碼RNA的異位表達(dá)在腫瘤的生物學(xué)過程中起著重要的作用[7-9]。LINC01116可促進(jìn)前列腺癌[11]、骨肉瘤[12]、乳腺癌[10]、卵巢癌[19]的進(jìn)展。但其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用還有待探究。

本文討論了LINC01116在多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC01116在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中均高表達(dá)，這提示LINC01116可能是一個與膠質(zhì)瘤發(fā)生相關(guān)的lncRNA。已有研究表明[19-21]，LINC01116促進(jìn)了癌癥細(xì)胞活性，主要涉及細(xì)胞增殖、遷移周期與凋亡等。本文根據(jù)干擾實(shí)驗證實(shí)了LINC01116基因的下調(diào)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，抑制侵襲與遷移。因此，我們證實(shí)上調(diào)的LINC01116與膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關(guān)。

越來越多的研究表明，lncRNA可以作為ceRNA發(fā)揮作用。例如，Chen，等[20]的研究表明，CDKN2BAS通過microRNA-153-5p(miR-153-5p)上調(diào)RhoGTPase活化蛋白18(ARHGAP18)的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移；Fang，等[21]人認(rèn)為lncRNAHNF1A-AS1通過調(diào)節(jié)miR-34a/SIRT1/p53的表達(dá)，發(fā)揮ceRNA的作用，促進(jìn)了結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展。然而，LINC01116是否通過調(diào)節(jié)miRNAs影響膠質(zhì)瘤進(jìn)展尚未見報道，本文中我們通過膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞細(xì)胞定位分析LINC01116的分布，確定LINC01116主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，這提示LINC01116可能通過ceRNA機(jī)制參與調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)程，miRDB和LncBasev.2軟件分析LINC01116可能作用的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)has-miR-4693-3P與LINC01116具有很高的匹配度，雙熒光素酶報告基因鑒定及細(xì)胞活性實(shí)驗進(jìn)驗證了has-miR-4693-3P與LINC01116的相互作用，結(jié)果提示LINC01116通過has-miR-4693-3P促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長?？傊?，本文研究結(jié)果表明LINC01116在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)、參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等，并通過ceRNA機(jī)制參與膠質(zhì)瘤進(jìn)程，這將為LINC01116作為新的膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。