楊 婕，劉宏明，陳 云，陳 冉，張景勍*

（1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶高校藥物工程研究中心，重慶400016；2重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶408400）

吳茱萸［Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.］，是蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。吳茱萸堿（evodiamine，EV）是中藥吳茱萸的活性成分，可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，作為多靶點(diǎn)藥物用于治療腫瘤、肥胖、疼痛、炎癥、心血管疾病和阿爾茨海默病等疾?。?-4］。但由于EV 水溶性低，生物利用度低，限制了臨床應(yīng)用［5］。磷脂被廣泛用于改善中藥活性成分的水溶性和滲透性，能提高藥物的吸收和生物利用度，并且由于本身是細(xì)胞膜成分，攜帶藥物進(jìn)入組織細(xì)胞時(shí)對細(xì)胞無毒性［6］。羥丙基-β-環(huán)糊精可以增加難溶性藥物的溶解度和穩(wěn)定性，并且具有抑制P 糖蛋白的作用［7］。本研究結(jié)合磷脂和羥丙基-β-環(huán)糊精作為藥物遞送載體的優(yōu)勢，首次制備負(fù)載EV 的脂質(zhì)納米粒（evodiamine lipidic nanoparticle，ELN），用于提高EV 在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和在體腸吸收特性，旨在為EV 的臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

吳茱萸堿（純度大于99%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司）；卵磷脂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；羥丙基-β-環(huán)糊精（江蘇泰興新鑫醫(yī)藥輔料有限公司）；和厚樸酚（內(nèi)標(biāo)，純度大于99%，西安小草植物科技有限公司）；甲醇（色譜級，美國新天地科技有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

LC-2010AHT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB204-S電子天平（瑞士Mettler-Toledo儀器公司）；XSP-36-1600X 型生物顯微鏡（鳳凰光學(xué)股份有限公司）；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Nano-ZS90 型馬爾文粒徑測定儀（英國馬爾文公司）；3000N型掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.3 動(dòng) 物

清潔級SD 大鼠，雄性，體重（250±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK-（渝）2018-0003。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 ELN的制備與表征

2.1.1 ELN 的制備 稱取EV、卵磷脂和羥丙基-β-環(huán)糊精（物質(zhì)的量比，1∶2.47∶5.11）置于50 mL的磨口圓底燒瓶中，加入無水乙醇20 mL，60 ℃水浴攪拌5 h（1 200 r/min）后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，殘余物真空干燥后用氯仿溶解并過濾，沉淀用少量氯仿洗滌，合并濾液，減壓回收有機(jī)溶劑，所得固體真空干燥后即為ELN。

2.1.2 光學(xué)顯微鏡觀察ELN 的形態(tài) 分別取少量包含EV、卵磷脂和羥丙基-β-環(huán)糊精的物理混合物，ELN 固體置于載玻片上，將載玻片置于顯微鏡下，先于10 倍鏡下觀察，然后在40 倍鏡下觀察并照相。

2.1.3 掃描電子顯微鏡觀察ELN 的形態(tài) 將ELN 粉末分散于pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中，并將懸浮液1滴置于載玻片上。經(jīng)固定、脫水和凍干后，涂覆金，并用掃描電子顯微鏡觀察和拍攝其表面形態(tài)。

2.1.4 ELN 的粒徑和電位 稱取ELN 20 mg 混懸于超純水3 mL 中，用超純水稀釋到原濃度的1/2，采用馬爾文粒徑測定儀測定ELN的粒徑和電位。

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 給藥方案和取血點(diǎn) 選用成年健康SD 大鼠6 只，隨機(jī)分為2 組，每組3 只。兩組SD 大鼠在給藥前12 h 禁食不禁水。兩組SD 大鼠分別單劑量灌胃給藥EV 和ELN（按EV 計(jì)，給藥劑量為250 mg/kg）。 給藥后在預(yù)先設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)（0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h）進(jìn)行眼底取血，將血樣置于含肝素的EP 管中，離心10 min 后分離血漿，置于-80 ℃冰箱保存［8-9］。

2.2.2 血漿樣品處理 取血漿樣品150 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作液（20 μg/mL）10 μL，渦旋30 s，加入氨水75 μL，渦旋30 s，加入乙醚750 μL，渦旋3 min，取上清液600 μL至離心管中，40 ℃水浴揮干乙醚后，加入甲醇100 μL 渦旋1 min，離心半徑10 cm，12 000 r/min，離心10 min，取上清液40 μL 進(jìn)樣檢測［9］。

2.2.3 色譜條件 色譜柱Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 動(dòng) 相 為 甲 醇- 水（75∶25）；檢測波長為225 nm；流速為1 mL/min；柱溫為35 ℃。內(nèi)標(biāo)（IS）為和厚樸酚，進(jìn)樣量為40 μL［10］。

2.2.4 樣品中藥物含量的測定 精密稱取EV 20.00 mg，IS 10.00 mg，用甲醇溶解并用100 mL 棕色量瓶定容，得EV工作液和IS工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：取空白血漿150 μL，精密加入IS工作液（20 μg/mL）10 μL，渦旋30 s，再分別加入不同質(zhì)量濃度的EV 工作液稀釋液40 μL，得EV梯度濃度范圍為10～2 000 ng/mL 的系列含藥血漿溶液（各樣品中IS 的質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL），依照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行血漿樣品處理后，在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測定各樣品中EV 和IS 的峰面積，以EV 和IS的峰面積比（A）對EV 的質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。

精密度：制備EV 質(zhì)量濃度分別為100、500、1500 ng/mL 的血漿溶液，平行配制3 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行血漿樣品處理后，同1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5 次檢測，考察其日內(nèi)精密度；持續(xù)進(jìn)樣5 d檢測，考察其日間精密度。

回收率：制備低、中、高濃度的EV 血漿溶液，平行配制3 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行血漿樣品處理后，進(jìn)樣檢測EV 的峰面積（Ar）。另外配制低，中，高濃度的EV 溶液各3份，加入IS（IS濃度均為0.1 μg/mL），并均用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，使其與含EV 的血漿樣品處理后的濃度相同，進(jìn)樣測定EV的峰面積（As）。Ar/As即為EV的回收率。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)測得數(shù)據(jù)，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線。用DAS 2.1.1 軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2.3 在體腸吸收實(shí)驗(yàn)

2.3.1 色譜條件 色譜柱Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 動(dòng) 相 為 甲 醇- 水（75∶25）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長為225 nm。進(jìn)樣量為20 μL。

2.3.2 單向腸灌流模型考察在體腸吸收情況SD大鼠給藥前18 h禁食不禁水。將大鼠麻醉后固定，沿腹中線打開，暴露腹腔。在胃幽門、賁門兩側(cè)各剪開一個(gè)小口，插管，將兩端用線繩結(jié)扎。人工胃液排除胃內(nèi)容物（重復(fù)3 次），分別灌入EV 和ELN 混懸液（按EV 計(jì)，給藥劑量為90 μg/mL）4 mL，2 h 后取出藥液，沖洗胃內(nèi)的剩余藥液，用10 mL 量瓶定容。依次找到以下腸段：幽門以下1 cm 處為十二指腸段，幽門向下15 cm 處為空腸段，至盲腸上段20 cm 處為回腸段，盲腸后段為結(jié)腸段。分別取各腸段10 cm，在上端和下端分別插管結(jié)扎，用37 ℃生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈?？瞻譑rebs-Ringer 循環(huán)液以0.4 mL/min 流速平衡10 min后，更換為含藥循環(huán)液，流速降低為0.2 mL/min，計(jì)時(shí)1 h 收集灌流液。沖洗胃腸道內(nèi)的剩余藥液，用25 mL 量瓶定容，并在-20 ℃條件保存，在“2.3.1”項(xiàng)下條件檢測EV 含量。試驗(yàn)結(jié)束后測量各腸斷長度和內(nèi)徑，計(jì)算藥物吸收速率常數(shù)（Ka）和有效滲透率（Peff）［9］。

3 結(jié) 果

3.1 ELN的制備與表征

如圖1-A 和1-B 所示，在光學(xué)顯微鏡下，包含EV、卵磷脂和羥丙基-β-環(huán)糊精的物理混合物呈大小不一的結(jié)晶狀，而ELN 粉末呈不規(guī)則、非晶型，分布較物理混合物更加均一。如圖1-C 所示，在掃描電子顯微鏡下，ELN 呈球形或類球形。粒徑電位結(jié)果顯示，ELN 的平均粒徑為180.10 nm，平均Zeta電位為-17.90 mV。

Figure 1 Morphology of evodiamine lipidic nanoparticle(ELN)A: Optical photomicrographs of physical mixture;B: Optical photomicrographs of ELN;C: Scanning electron micrograph of ELN

3.2 ELN在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

在該色譜條件下，EV 與IS 的保留時(shí)間分別為5.6 和8.1 min，峰形良好且血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。以EV 與IS 的峰面積比（A）對EV 的質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：A=1.128 9c + 0.070 9，r =0.999 8，EV 在10～2 000 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。血漿樣品溶液的日內(nèi)精密度RSD 為1.40% ～4.10%，日間精密度RSD 為1.65% ～3.50%?；厥章蕿?02.70% ～108.55%。專屬性、線性、精密度、回收率等實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合方法學(xué)要求，表明處理血漿的方法合理，符合測定要求，該法可行。

SD大鼠單劑量灌胃給藥EV和ELN混懸液（按EV 計(jì)，給藥劑量為250 mg/kg）后，按照“2.2.1”項(xiàng)下采集各時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下血漿處理辦法，進(jìn)行HPLC 分析，測定EV 的大鼠血漿濃度。灌胃給藥EV 和ELN（按EV 計(jì)，給藥劑量為250 mg/kg）的血藥濃度-時(shí)間曲線如圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ELN 能顯著增加大鼠體內(nèi)EV 的濃度，提高EV的口服生物利用度。采用DAS 2.1.1軟件分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，非房室模型和房室藥代模型參數(shù)見表1和表2，EV和ELN的藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為均符合二室模型。ELN 將EV 的平均生物利用度提高4.73 倍，平均峰濃度提高了3.79 倍，平均滯留時(shí)間延長了1.60倍。

Figure 2 Plasm concentration-time profiles of evodiamine (EV) in rats after oral administration of ELN and EV at EV dose of 250 mg/kg(xˉ± s, n = 3)

Table 2 Main pharmacokinetic parameters calculated with compartment model after oral administration of ELN and EV at EV dose of 250 mg/kg (xˉ± s, n = 3)

Table 1 Main pharmacokinetic parameters calculated with non-compartment model after oral administration of ELN and EV at EV dose of 250 mg/kg (xˉ± s, n = 3)

3.3 在體腸吸收實(shí)驗(yàn)

大鼠胃部單向灌流2 h，腸段單向灌流1 h 后，收集剩余ELN 和EV 并測定其含量，計(jì)算Ka和Peff。ELN 和EV 在胃中的Ka以及在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Ka和Peff見表3。結(jié)果表明，ELN 在胃腸段的Ka和Peff均大于原料藥EV。對不同胃腸段的Ka和Peff進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明ELN 在胃部和4 個(gè)腸段的Ka和Peff與原料藥EV 混懸液相比均存在顯著性差異（P ＜0.05）。其中，相比EV，ELN 的平均Ka在結(jié)腸增長倍數(shù)最高（比EV 高31倍），ELN 的平均Peff在十二指腸增長倍數(shù)最高（比EV 高11 倍）。EV 在胃部具有最高Ka，ELN 在結(jié)腸具有最高的Ka，提示ELN 在結(jié)腸吸收最快。EV 在結(jié)腸具有最高Peff，ELN 在十二指腸具有最高Peff。以上結(jié)果提示ELN 增強(qiáng)了胃腸道對EV 的吸收，而且可能具有結(jié)腸靶向作用。

Table 3 Absorption rate constant and effective permeability coefficient of ELN and EV (xˉ± s, n = 3)

4 討 論

EV 具有低溶解性的特點(diǎn)，按照生物藥劑學(xué)分類 系 統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）的標(biāo)準(zhǔn)可將其歸為BCS二類藥物［11］。水溶性差的特點(diǎn)使其難以被吸收，生物利用度低，藥理活性難以發(fā)揮。

磷脂是人體細(xì)胞膜成分，具有良好的生物相容性，可顯著增強(qiáng)難溶性藥物EV 的水溶性，使其更易從親水環(huán)境轉(zhuǎn)移到親脂環(huán)境的腸上皮細(xì)胞膜［12-13］。羥丙基-β-環(huán)糊精可增加難溶性藥物的溶解度（前期實(shí)驗(yàn)表明：EV 在水中的溶解度小于0.03 μg/mL，而羥丙基-β-環(huán)糊精和EV 形成的環(huán)糊精包合物在水中的平均溶解度為18.46 μg/mL，表明羥丙基-β-環(huán)糊顯著提高了EV 的水溶性），是美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的可用于注射的安全的藥用輔料，其疏水的內(nèi)腔和親水的表面可包裹磷脂分子的脂肪?；?xì)滏?，通過范德華力或靜電作用力等發(fā)生包結(jié)作用，形成穩(wěn)定的脂質(zhì)納米粒［14］。

為更好地提高EV 的水溶性，以促進(jìn)其吸收，本研究采用羥丙基-β-環(huán)糊精結(jié)合卵磷脂來遞送EV，成功構(gòu)建脂質(zhì)納米粒ELN（前期實(shí)驗(yàn)表明：在熱分析實(shí)驗(yàn)中，ELN 的特征吸熱峰相比EV 和輔料有顯著差異，表明ELN 成功合成），以期改善EV 的水溶性，提高EV 的生物利用度。在體腸吸收特性表明ELN 能夠使EV 更好地被胃腸道吸收，且ELN在結(jié)腸處吸收增加顯著，這可能是因?yàn)橹|(zhì)納米?？稍黾覧V 的淋巴運(yùn)輸，而結(jié)腸處存在大量淋巴液［9］。藥代動(dòng)力學(xué)特性表明，ELN 有效促進(jìn)了EV的體內(nèi)吸收，顯著提高了EV 的生物利用度。本研究為提高難溶性天然藥物的理化性質(zhì)改善提供了依據(jù)，為難溶性天然藥物的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。