李 芳，辛俊勃，施 秦*，毛成瓊

（1江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，鹽城224005；2維克森林大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤生物學(xué)部，美國(guó)溫斯頓塞勒姆27157）

光動(dòng)力學(xué)治療（photodynamic therapy，PDT）是將光吸收劑與非電離光的物理能相結(jié)合進(jìn)而殺死細(xì)胞。但是，它在腫瘤治療中并不常用，原因是非靶向的光吸收劑也能夠被正常組織攝取，經(jīng)光照后即可引發(fā)嚴(yán)重的副作用［1］。為此，尋求光吸收劑腫瘤靶向傳遞的新策略是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

近紅外光免疫治療（near infrared photoimmunotherapy，NIR-PIT）是一種新興的靶向腫瘤治療方法，通過(guò)將單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）與光吸收劑IRDye700DX（IR700）偶聯(lián)形成抗體-光吸收劑結(jié)合物（antibody-photoabsorber conjugate，APC）（圖1-A），經(jīng)近紅外（NIR）光活化導(dǎo)致細(xì)胞壞死或免疫原性死亡［2］。與常規(guī)的腫瘤治療手段不同，NIR-PIT 不僅可以特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，還能夠有效控制和治療腫瘤轉(zhuǎn)移［3-4］。目前，已有NIR-PIT 制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，如靶向EGFR 的cetuximab-IR700 被用于不可手術(shù)治療的頭頸癌的臨床研究，Ⅰ期與Ⅱ期臨床試驗(yàn)均非常成功，已于2019 年進(jìn)入快速追蹤的全球Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。早期臨床數(shù)據(jù)顯示，NIR-PIT 治療復(fù)發(fā)性頭頸癌的效果優(yōu)于二、三線療法［5］。鑒于NIR-PIT 在腫瘤靶向治療中的巨大潛力與應(yīng)用前景，本文將從NIRPIT 的要素、影響因素、抗腫瘤作用機(jī)制、存在問題及對(duì)策等方面進(jìn)行總結(jié)。

Figure 1 Components of Near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT)A: Synthetic strategy of antibody-photoabsorber conjugate; B: Structure diagram of IR700-NHS

1 NIR-PIT的要素

NIR-PIT 需要mAb、光吸收劑與NIR 光3 個(gè)要素，是將抗體靜脈注射的特異性與光吸收劑經(jīng)NIR光照射后的急性毒性相結(jié)合的一種靶向光動(dòng)力學(xué)療法，也是近年腫瘤治療研究中的熱點(diǎn)之一。雖然大多數(shù)的APC 還處于實(shí)驗(yàn)室或動(dòng)物研究階段，但前期的研究結(jié)果均證實(shí)了NIR-PIT 能夠高效殺滅靶腫瘤細(xì)胞，且不會(huì)破壞非靶腫瘤或正常組織。

1.1 mAb

在現(xiàn)有靶向治療中，mAb 治療的歷史最為悠久。截至2018 年5 月10 日，F(xiàn)DA 已批準(zhǔn)80 個(gè)治療性mAb，但其使用劑量較大，成本非常高。也有研究將低劑量的mAb 用作傳遞放射性核素、化學(xué)藥物或生物毒素等的載體［1］，結(jié)果顯示其靶向性能優(yōu)良。由于mAb 的腫瘤特異性高，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面的抗原相結(jié)合，可使NIR-PIT 具有腫瘤靶向性，從而克服了傳統(tǒng)PDT 缺乏特異性、副作用大的缺陷。研究還發(fā)現(xiàn)，mAb 在臨床上也會(huì)出現(xiàn)耐藥性，如trastuzumab［6］、cetuximab［7］等。另外，mAb 進(jìn)入體內(nèi)后，首先與血管周圍的靶細(xì)胞結(jié)合，這種高親和力會(huì)導(dǎo)致抗體被困在血管周圍間隙而不能進(jìn)一步滲透到腫瘤。但是，NIR-PIT 可以解決這個(gè)問題，給予光照后，NIR-PIT 會(huì)迅速對(duì)該層細(xì)胞造成毒性作用從而引起血管周圍細(xì)胞突然壞死與血管完整性喪失。此時(shí)，腫瘤組織間隙液壓下降，血管擴(kuò)張且通透性顯著增加，更有助于APC 進(jìn)入腫瘤深處［8］，也有望克服mAb的耐藥性問題。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的抗體主要靶向EGFR［9］、HER2［4］、TROP2［10］、CD47［11］、CD146［12］、DLL3［13］等，涉及的腫瘤有卵巢癌［14］、胃癌［15］、膀胱癌［16］、黑色素瘤［12］等。

1.2 光吸收劑

雖然靶向光療概念的提出已經(jīng)有30 多年了，但是傳統(tǒng)PDT 中使用的光吸收劑仍大多為選擇性差疏水性大的小分子。它們不僅能夠與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，也可以和包括皮膚、其他上皮表面在內(nèi)的正常細(xì)胞結(jié)合而引起不必要的光毒性。盡管學(xué)者們嘗試將多種常規(guī)光吸收劑與mAb 相結(jié)合以改善其選擇性，然而效果并不明顯，尤其在其體內(nèi)療效評(píng)價(jià)上。

IR700 是一種具有高消光系數(shù)和中熒光量子產(chǎn)率的硅酞菁染料，NIR光激發(fā)波長(zhǎng)為690 nm。它對(duì)自然光具有光化學(xué)穩(wěn)定性，即便在高染料/蛋白比時(shí)也不會(huì)聚集，且無(wú)非特異性的蛋白結(jié)合［17］。因其水溶性好，故而不易進(jìn)入細(xì)胞［18］。將IR700連接到抗體形成APC 后，APC 靜脈注射的藥代動(dòng)力學(xué)與抗體相似，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的高靶向濃集和最小的非靶向結(jié)合。與抗體-藥物結(jié)合物（antibodydrug conjugate，ADC） 如 Kadcyla?（trastuzumab emtansine，T-DM1）相比，ADC會(huì)因?yàn)樗幬镌谘旱倪^(guò)早釋放而造成脫靶毒性［19］，而APC 選用的光吸收劑IR700無(wú)暗毒性，與APC分離后可通過(guò)尿液排泄，故而APC 的安全性更好［20］。不僅如此，IR700還具有熒光成像功能，在腫瘤治療中借此可以確定光照部位，從而減少非相關(guān)組織的光暴露，同時(shí)可以非侵入性地監(jiān)控治療效果。

1.3 NIR光

NIR光療本身不是熱療或破壞性療法，因此可以安全地輸送到正常組織而沒有毒性。波長(zhǎng)在700 nm 附近的NIR 光在活組織內(nèi)表現(xiàn)出較高的光學(xué)穿透力，因?yàn)樵诖瞬ㄩL(zhǎng)下，內(nèi)源性發(fā)色團(tuán)（水、血紅蛋白、膠原蛋白等）的吸收度極低。除了借助mAb 的主動(dòng)靶向性外，還可通過(guò)控制光照部位，選擇性活化靶部位的APC 而殺死腫瘤細(xì)胞。NIRPIT 使用的NIR 光是非電離的，對(duì)DNA 無(wú)損傷，能夠穿透至組織內(nèi)1 ～2 cm處［21］，比傳統(tǒng)PDT中用的較低波長(zhǎng)光的組織穿透性更好（紫外或可見光的穿透深度為1 ～3 mm），故而適合于肺癌［4］、彌漫性腹膜卵巢癌［14］的治療。但是人體腫瘤往往在皮膚下的深層組織，NIR光的穿透性相對(duì)于臨床需要仍然是有限的，為此，NIR-PIT 還僅適用于NIR 光可以照射到的淺表性腫瘤的治療［14］。

2 NIR-PIT抗腫瘤效果的影響因素

研究表明，影響PIT 抗腫瘤效果的因素涉及APC 濃度、光劑量、光源的功率密度等［22］。在體外細(xì)胞培養(yǎng)模型上，當(dāng)NIR 光劑量固定為2 J/cm2時(shí)，Pan-IR700 在0.3 ～3 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與細(xì)胞死亡率呈正單指數(shù)相關(guān)（圖2-A），但繼續(xù)增加APC 的質(zhì)量濃度（高于3 μg/mL），細(xì)胞死亡率并沒有變化，這是由于此刻細(xì)胞膜抗原已達(dá)飽和。當(dāng)APC 質(zhì)量濃度固定，以100 mA 連續(xù)波、400 mA 連續(xù)波與1 733 mA 脈沖波3 種功率設(shè)定分別給予0.2 ～5 J/cm2的光劑量，3 種LED 光功率下均可觀察到死細(xì)胞比例隨著光劑量增加而升高，但3種功率水平對(duì)細(xì)胞死亡率沒有明顯影響（圖2-B）。將Pan-IR700 濃度與光劑量的乘積（1.5 J·μg·mL-1·cm-2）作為有效劑量參數(shù)，3 組不同的Pan-IR700 濃度與光劑量但乘積相同的組合的細(xì)胞死亡率無(wú)顯著性差異（圖2-C）。體內(nèi)原位乳腺癌模型數(shù)據(jù)再次證實(shí)PIT 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和結(jié)合物劑量與光劑量的乘積有關(guān)。因此，可以通過(guò)增加APC 的劑量（不超過(guò)飽和上限）或光劑量（不超過(guò)熱上限）來(lái)提高PIT 的細(xì)胞毒作用。而對(duì)于某個(gè)恒定的細(xì)胞殺滅水平，可以通過(guò)調(diào)節(jié)APC 濃度和光劑量來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，與光劑量相比，光源的功率密度并非是決定PIT 效果的重要因素，而且當(dāng)光劑量固定時(shí)，光的傳遞方式（連續(xù)波或脈沖波）對(duì)PIT 效果也沒有影響。但是，以相同的光劑量照射，激光在體內(nèi)外對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用均強(qiáng)于LED光［23］。

Figure 2 Phototoxicity of Pan-IR700 mediated PIT[22]A:At a constant light dose of 2 J/cm2,the correlation between the proportion of dead cells and the concentration of Pan-IR700;B:At a fixed concentration of Pan-IR700,the correlation between the proportion of dead cells and the light dose;C:The similar cell killing effect could be achieved by three different combinations:(1) 3 μg/mL and 0.5 J/cm2,(2) 1 μg/mL and 1.5 J/cm2,and (3) 0.3 μg/mL and 5 J/cm2 (P ＞0.05)

另外，Peng 等［24］發(fā)現(xiàn)cetuximab-IR700 的靶向PIT 效果還取決于細(xì)胞表面EGFR 的密度，EGFR密度最高的A431 細(xì)胞對(duì)PIT 最為敏感。不僅如此，腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在生物學(xué)特性也對(duì)PIT 的功效有重要影響。雖然scc-U2 細(xì)胞的EGFR 表達(dá)高于scc-U8 細(xì)胞，但由于scc-U2 細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL 的表達(dá)也明顯高于scc-U8 細(xì)胞，故而PIT對(duì)scc-U8 細(xì)胞的殺滅效果更好。Nagaya 等［25］的研究也支持了PIT 的療效與抗原表達(dá)水平有關(guān)，與EGFR 中度表達(dá)的MDAMB231 細(xì)胞相比，EGFR 高表達(dá)的MDAMB468 細(xì)胞對(duì)NIR-PIT 更敏感。雖然各NIR-PIT 組均能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)、顯著延長(zhǎng)生存期，但是，在給予總濃度相等的APC 的情況下，少量多次給藥并重復(fù)光照能夠進(jìn)一步改善抗腫瘤效果［25］。此外，腫瘤部位的氧也會(huì)影響PIT 的效果，體外單線態(tài)氧清除劑廢除了PIT 的作用，而體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)短暫缺氧的腫瘤進(jìn)行PIT 并沒有任何治療效果［26］。

3 NIR-PIT的抗腫瘤作用機(jī)制

3.1 APC的細(xì)胞定位

NIR-PIT 的抗腫瘤作用機(jī)制與APC 在靶細(xì)胞的分布密切相關(guān)，定位于線粒體或者細(xì)胞質(zhì)的光吸收劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而分布于細(xì)胞膜的光吸收劑會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壞死［27］。 用遠(yuǎn)紅外染料CF640R（640R）替代IR700以避免對(duì)活細(xì)胞造成光毒性，結(jié)合物Pab-640R 主要分布于細(xì)胞膜上，但由于內(nèi)吞作用，隨著細(xì)胞與Pab-640R 共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合物也會(huì)逐漸分布至細(xì)胞囊泡［28］（圖3-A）。 相似現(xiàn)象也發(fā)生在Tra-IR700 處理的3T3/HER2 細(xì)胞中，與LysoTracker-Green 共定位可見APC 內(nèi)化后主要分布于溶酶體中［1］（圖3-B）。SAM等［27］比較了美洲駝單結(jié)構(gòu)域抗體（VHH）光吸收劑結(jié)合物（VHH［PS］）與細(xì)胞穿膜肽偶聯(lián)的VHH［PS］（VHH［PS］-CPP）的抗腫瘤效果，結(jié)果顯示VHH［PS］的細(xì)胞殺滅效果顯著優(yōu)于內(nèi)化的VHH［PS］-CPP，表明APC 分布于細(xì)胞膜能夠獲得更好的NIR-PIT效果。

3.2 NIR-PIT后細(xì)胞膜的形態(tài)與功能變化

絲狀偽足是從細(xì)胞邊緣伸出來(lái)的富含肌動(dòng)蛋白的薄手指樣突起，普遍存在于腫瘤細(xì)胞中，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及促進(jìn)擴(kuò)散癌細(xì)胞在次生器官的生存與增殖中發(fā)揮重要作用。以NIR 光照射Tra-IR700處理的3T3/HER2 細(xì)胞后15 min 可觀察到絲狀偽足的數(shù)量明顯減少（圖3-C）［29］。用顯微鏡還可觀察到靶細(xì)胞溶脹、形成氣泡，繼而囊泡破裂（圖3-D），且細(xì)胞膜破損的嚴(yán)重程度隨光劑量的增強(qiáng)而加?。?0］。3D 動(dòng)態(tài)低相干定量相顯微鏡（3D LCQPM）通過(guò)低相干光源以納米分辨率連續(xù)獲得細(xì)胞膜的形貌圖像而無(wú)需任何標(biāo)記。用3D LC-QPM觀察PIT 后的細(xì)胞形態(tài)［31］，3T3/HER 細(xì)胞經(jīng)NIR 光照射48 s 后可觀察到細(xì)胞溶脹、產(chǎn)生一些小氣泡，這些小氣泡變大并積聚成更大的氣泡直至細(xì)胞膜破裂（圖3-E）。在NIR 光照射64 s 的細(xì)胞中，在成像時(shí)即觀察到1/3 的細(xì)胞膜已經(jīng)破裂（圖3-F），而在NIR 光照射76 s 的細(xì)胞中絕大多數(shù)細(xì)胞膜已經(jīng)破裂了（圖3-G），且細(xì)胞膜破裂發(fā)生在mAb-染料偶聯(lián)物的外周結(jié)合位點(diǎn)附近，可能是因?yàn)榧?xì)胞結(jié)合的偶聯(lián)物聚集暴露在光線下會(huì)引起表面張力的變化，從而使細(xì)胞滲漏。

在細(xì)胞膜由完整、損傷到破裂的過(guò)程中，其通透性也發(fā)生了明顯的變化。在NIR 光照射后立即就觀察到高滲透壓條件下Na+（直徑0.5 nm）的迅速內(nèi)流，但在質(zhì)膜損傷初期葡聚糖分子（直徑～3.7 nm）尚不能通過(guò)。在光照后鈣黃綠素（直徑1.4 nm）也不能立即從細(xì)胞內(nèi)流出，但光照3 min后它逐漸從細(xì)胞中消失，直至在明場(chǎng)中觀察到明顯的質(zhì)膜損傷。而熒光分子EthD-1（直徑2.6 nm）是在明場(chǎng)中觀察到許多氣泡后才進(jìn)入細(xì)胞?？梢姡?dāng)NIR 光照射使質(zhì)膜大面積受損時(shí)，其滲透性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大［32］。雖然微小的質(zhì)膜穿孔通常不會(huì)造成細(xì)胞死亡，但是NIR-PIT 引起的微損傷隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不可逆地加重，故而，微小的質(zhì)膜損傷觸發(fā)了質(zhì)膜滲透性的增強(qiáng)。因此，mAb 與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合后，在NIR 光照射后的數(shù)分鐘（最早1 min）內(nèi)，即可觀察到靶細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂［33-34］，從而引起細(xì)胞的快速不可逆的壞死。在NIR-PIT 后，使用超極化富馬酸酯的代謝MRI 顯示在表達(dá)EGFR 的A431 腫瘤異種移植物中產(chǎn)生了蘋果酸，也為NIR-PIT 誘導(dǎo)的光敏性腫瘤壞死提供了直接證據(jù)［35］。

3.3 NIR-PIT的細(xì)胞毒作用機(jī)制

Figure 3 Cellular localization of APC and morphological changes of cell membrane after NIR-PITA:Confocal images of the distribution of Pab-640R in P-gp positive and GFP-expressing 3T3-MDR1 cells.Nucleus was stained by Hoechst 33342(blue)[28]; B:Lysosomal localization of Tra-IR700 6 h after coincubation with 3T3/HER2 cells [1];C:Change in amount of filopodia on 3T3/HER2 cells after NIR light irradiation [29];D:In vitro microscopic images of A431 cells after PIT [30];E-G:3D-LC QPM images of 3T3/HER cells after PIT.NIR light exposure time was 48 s (E),64 s (F) and 76 s (G),respectively.Red asterisk represents a bleb,while yellow arrowhead represents a flying fragment [31]

Sato 等［36］闡明了由NIR-PIT 引起的細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。IR700-NHS 的結(jié)構(gòu)如圖1-B，該酯可用于偶聯(lián)mAb 的賴氨酸殘基。從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，基本扁平的芳香族酞菁環(huán)被保持在芳香族核心上方和下方的氧基硅丙基-氨基三丙基磺酸基團(tuán)所抵消。該立體化學(xué)結(jié)構(gòu)使得即使在抗體上多取代時(shí)也能防止多個(gè)芳香環(huán)的π 堆積，從而分別減輕了染料和mAb 的淬滅與聚集。6 個(gè)附加的磺酸基團(tuán)和2 個(gè)四氨基基團(tuán)使染料在生理pH 下為兩性離子，故而所得的mAb-IR700 結(jié)合物具有高度水溶性。暴露于NIR 光后，IR700 分子與APC 均發(fā)生了光誘導(dǎo)的化學(xué)變化。在NIR-PIT 處理的腫瘤床中常為缺氧或富電子供體的環(huán)境，IR700 經(jīng)歷光化學(xué)配體反應(yīng)，分解時(shí)以光劑量依賴的方式先失去一個(gè)繼而失去第二個(gè)酞菁環(huán)核平面上方或下方的軸向磺酸臂，并使其余分子變得非常疏水和無(wú)熒光特性［17］（圖4-A）。這種化學(xué)變化導(dǎo)致形成硅酞菁IR700 環(huán)的Z-堆積多聚體或水不溶性的APC 或APC-抗原復(fù)合物的聚集體，從而引起IR700 熒光的淬滅。光化學(xué)配體釋放反應(yīng)導(dǎo)致APC-抗原復(fù)合物中的物理化學(xué)變化，這會(huì)損傷跨膜靶蛋白，從而降低細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致水流入細(xì)胞隨后引起起泡和細(xì)胞裂解（圖4-B）。

利用三維動(dòng)態(tài)活細(xì)胞顯微鏡、放射性和熒光探針以及生物標(biāo)記物進(jìn)一步研究了NIR-PIT 細(xì)胞毒作用的機(jī)制［5］。3D LC-QPM成像顯示，在細(xì)胞膜受損后，水流入細(xì)胞，細(xì)胞體積一開始就膨脹了約3 倍。 用雙側(cè)倒置選擇性平面照明顯微鏡（diSPIM）觀察NIR-PIT 后細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。細(xì)胞的快速溶脹導(dǎo)致膜更大程度地撕裂，使胞漿內(nèi)的物質(zhì)釋放到細(xì)胞外空間。借助diSPIM 觀察表達(dá)胞質(zhì)綠色熒光蛋白（GFP）的細(xì)胞，結(jié)果顯示GFP在細(xì)胞溶脹過(guò)程中被限制在細(xì)胞內(nèi)，但是一旦細(xì)胞膜破裂，它便迅速分散。結(jié)合于細(xì)胞膜的APC 主要通過(guò)這一機(jī)制誘導(dǎo)靶細(xì)胞的快速壞死，這也是NIR-PIT抗腫瘤的主要作用機(jī)制（圖5）。

Figure 4 Mechanism of NIR-PIT mediated cytotoxicityA:Scheme of chemistry basis for NIR-PIT;B:Schematic diagram for physical changes of APC-antigen complex [5,17]

Figure 5 Schematic diagram of NIR-PIT induced cellular toxicity [17]

除此之外，Mitsunaga 等［1］觀察到NIR 光照射后，活性氧自由基（ROS）的生成造成了靶受體表達(dá)腫瘤細(xì)胞的死亡。在另一項(xiàng)研究中，NIR-PIT 抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制包括ROS 生成、葡萄糖代謝降低以及受體表達(dá)的下降［12］。也有研究觀察到，NIRPIT 過(guò)程中既有單線態(tài)氧的生成，也有ROS 生成［26］，該機(jī)制類似于PDT，APC 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體蓄積可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而其在溶酶體的蓄積可延緩細(xì)胞凋亡時(shí)間［37］。另外，NIR-PIT 還能夠在體內(nèi)引起非靶向的與血液中APC 濃度相關(guān)的血管阻塞，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［38］。

4 NIR-PIT存在的問題及對(duì)策

4.1 組織穿透深度

NIR-PIT 使用LED 燈和激光光源進(jìn)行表面光照在動(dòng)物模型上取得了良好的療效。被FDA 批準(zhǔn)臨床Ⅲ期試驗(yàn)的cetuximab-IR700 也是通過(guò)靜脈給藥，并于約24 h 后用激光光源以690 nm 波長(zhǎng)NIR光對(duì)腫瘤進(jìn)行照射治療，許多患者的腫瘤明顯縮小，且副作用很小。NIR-PIT 的療效取決于APC 進(jìn)入靶組織的能力以及將NIR 光傳遞到該組織的能力。NIR 光可通過(guò)外部光源輕松地傳遞到口腔和皮膚的病變處，但是，在更深處的腫瘤中，由于組織中天然吸收劑的存在，光會(huì)迅速衰減，且單個(gè)光源的照射可能會(huì)產(chǎn)生異質(zhì)性NIR 光暴露，從而導(dǎo)致腫瘤的治療不充分。

4.1.1 使用光纖擴(kuò)散器[21]由于腫瘤的大小通常超過(guò)組織中光的穿透能力，因此，在臨床治療中，可通過(guò)放置在腫瘤組織間隙的光纖來(lái)傳遞光至更深的腫瘤。由于可以沿光纖的軸向均勻地傳輸光，所以，使用光纖擴(kuò)散器的間隙光照對(duì)深度沒有限制。在計(jì)算機(jī)斷層掃描或超聲引導(dǎo)下，通過(guò)針頭或?qū)Ч芡ǔＲ?0 ～15 mm 的間隔將擴(kuò)散器插入腫瘤中。來(lái)自光纖擴(kuò)散器的光可以使用前照明尖端或圓柱狀光擴(kuò)散器傳遞至目標(biāo)腫瘤內(nèi)，并散布到整個(gè)腫瘤床。Okuyama 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，間隙光能量為100 J/cm 時(shí)，擴(kuò)散器可以在光源周圍大約1 cm 處向腫瘤傳遞足夠的NIR 光，以實(shí)現(xiàn)有效的NIR-PIT；當(dāng)光能量為50 J/cm 時(shí)，該有效距離降為距光源直徑5 ～7 mm 的范圍，且兩種情況下在活體動(dòng)物中均未產(chǎn)生熱副作用。

4.1.2 內(nèi)窺鏡結(jié)合光纖擴(kuò)散器 理論上，光可以傳遞到體腔（例如腹膜和胸腔）中并擴(kuò)散，從而暴露出較大的表面積。但事實(shí)上，轉(zhuǎn)化到人體時(shí)往往沒有那么容易。將NIR 光傳送到諸如腹膜之類的體腔的一種解決方案就是使用針頭或內(nèi)窺鏡將光纖與遠(yuǎn)端光學(xué)擴(kuò)散器一起引入［39］。預(yù)先注射APC 后，腹膜轉(zhuǎn)移會(huì)結(jié)合藥物，然后通過(guò)內(nèi)窺鏡光纖擴(kuò)散器給予足夠的NIR 光，以相對(duì)最小的侵入性方式進(jìn)行治療。盡管該技術(shù)尚未整合到內(nèi)窺鏡引導(dǎo)治療中，但是光纖擴(kuò)散器傳輸光的可行性已被證實(shí)［21］。在靶向EGFR 的復(fù)發(fā)性頭頸癌患者的NIR-PIT Ⅰ期和Ⅱ期試驗(yàn)中，用間質(zhì)光纖擴(kuò)散器治療較大的腫瘤取得了成功。Nagaya 等［39］以胃癌腹膜擴(kuò)散小鼠為模型考察了基于內(nèi)窺鏡光纖擴(kuò)散器（圖6）的NIR-PIT 的療效，結(jié)果顯示治療后腫瘤立即喪失了熒光素酶活性，腹膜植入物出現(xiàn)急性細(xì)胞壞死和微出血。由于人體比小鼠的腹膜空間更大，故而將內(nèi)窺鏡或腹腔鏡用于人體的可操作性更強(qiáng)，因此，該技術(shù)有望擴(kuò)展到使用腹腔鏡、支氣管鏡、胸腔鏡或膀胱鏡等將光纖擴(kuò)散器放置在腫瘤內(nèi)或附近，并用于臨床腫瘤的治療。

4.1.3 外部光源與間質(zhì)光源聯(lián)用 Maruoka 等［40］比較了外部光源、組織間質(zhì)光源與兩者聯(lián)合使用時(shí)NIR-PIT 的效果。與其他光照組相比，外部/間質(zhì)光的組合顯示出最明顯的腫瘤體積減小和最慢的腫瘤再生長(zhǎng)。因此，與兩種單獨(dú)遞送方法相比，外部/間質(zhì)NIR 光源的組合產(chǎn)生了優(yōu)異的治療效果。

4.1.4 可植入無(wú)線發(fā)光二極管（LED） 雖然光纖擴(kuò)散器能夠?qū)⒐鈧鬟f至體內(nèi)幾乎任何地方，但是，此過(guò)程具有侵入性，且不適合于NIR-PIT 的重復(fù)曝光治療。為了限制深層組織中重復(fù)治療的侵入性，同時(shí)保證療效，Nakajima 等［41］開發(fā)了一種用于提供NIR 光的小型植入式無(wú)線LED。為了避免電池植入的潛在危害，通過(guò)從外部發(fā)射器線圈到與LED 耦合的植入接收線圈的電磁感應(yīng)確保為植入的LED 供電。電磁場(chǎng)設(shè)置為符合人類使用的標(biāo)準(zhǔn)限制，即低于0.1 mT。該無(wú)線LED 系統(tǒng)能夠通過(guò)使用低磁場(chǎng)來(lái)發(fā)射距發(fā)射器線圈20 cm 遠(yuǎn)的NIR光，且基于該LED系統(tǒng)的NIR-PIT能夠在體外殺死腫瘤細(xì)胞并抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。因此，該可植入無(wú)線LED 系統(tǒng)有望為治療人類深部區(qū)域的腫瘤提供新光源。

4.2 熱效應(yīng)

Figure 6 Multi-color fluorescence endoscopic system and NIR-PIT procedure[39]A:Multi-color fluorescence imaging system was composed of a clinically applicable fiber optic endoscope and light source; B:Cylindrical light diffuser with a NIR laser system; C:The endoscope was put into peritoneal cavity through a small incision,and the abdomen was inflated with air.Subsequently,abdominal cavity was exposed to NIR light by using the optical diffuser under endoscopic guidance

當(dāng)NIR 光被結(jié)合APC 的組織吸收時(shí)，局部會(huì)產(chǎn)生一定的熱量。在大多數(shù)情況下，這會(huì)導(dǎo)致亞臨床皮膚溫度升高。在暴露時(shí)間內(nèi)若溫度超過(guò)50 ℃，即可肉眼觀察到皮膚的熱損傷。在這種情況下，第2 天就會(huì)出現(xiàn)可見的紅斑跡象。但是，當(dāng)皮膚溫度保持在50 ℃以下時(shí)則觀察不到這種損害。適當(dāng)?shù)腘IR 光劑量對(duì)實(shí)施NIR-PIT 很重要，盡管它因腫瘤細(xì)胞類型、大小和光源等的不同而變化，但研究表明光劑量在10 ～100 J/cm2之間時(shí)NIR-PIT 是有效的［23，42-43］，而過(guò)度的曝光可能會(huì)導(dǎo)致與治療無(wú)關(guān)的非特異性的熱損傷。

Okuyama 等［44］研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論使用激光還是LED 光源，NIR 光都能迅速加熱皮膚，而且皮膚溫度的升高與所治療腫瘤的體積或APC 濃度之間沒有關(guān)聯(lián)。但是，使用臺(tái)式風(fēng)扇進(jìn)行空氣冷卻能夠有效降低皮膚的溫度，甚至可以降低約40% 的皮膚溫度變化。

表面皮膚溫度的升高在很大程度上取決于總的光劑量。當(dāng)光劑量恒定，激光引起的皮膚溫度升高大于LED 燈，這可能是激光的功率密度（600 mW/cm2）明顯高于LED 燈（50 mW/cm2）所致。當(dāng)NIR 光的功率密度高于600 mW/cm2時(shí)，在NIR-PIT后1 d 可觀測(cè)到燒傷。因此，雖然激光縮短了照射時(shí)間，但也導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)在暴露區(qū)域中光能沉積的增加，從而導(dǎo)致皮膚溫度過(guò)高。有趣的是，無(wú)論光源的功率密度高低或曝光時(shí)間長(zhǎng)短，腫瘤至少要獲得一定的總光劑量是NIR-PIT 治療成功的最重要決定因素。因此，可以通過(guò)使用較低的功率密度并延長(zhǎng)曝光時(shí)間來(lái)獲得腫瘤治療效果，同時(shí)避免皮膚的熱損傷［44］。

4.3 治療效果的快速評(píng)價(jià)

腫瘤大小變化是目前評(píng)價(jià)NIR-PIT 體內(nèi)抗腫瘤效果的常用指標(biāo)，但是腫瘤的尺寸變化通常在治療后3 ～4 d 才能夠顯現(xiàn)出來(lái)。為此，實(shí)時(shí)監(jiān)控PIT 的治療效果就顯得非常重要，尤其是在內(nèi)窺鏡引導(dǎo)下手術(shù)和介入治療過(guò)程中的即時(shí)反饋，因?yàn)橹挥腥绱瞬拍艽_定一個(gè)PIT 療程是否有效、是否需要重復(fù)治療以及是否需要更強(qiáng)的光照、額外的光劑量和/或APC 的劑量等。雖然在體外觀察到PIT可引起細(xì)胞形態(tài)的迅速變化，但遺憾的是目前臨床上可用于實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)PIT 效果的成像技術(shù)還很有限［45］。

4.3.1 葡萄糖攝取 根據(jù)Warburg 效應(yīng)，腫瘤生長(zhǎng)需要過(guò)量的葡萄糖，因此，用于提供局部葡萄糖代謝指標(biāo)的18F-FDG PET 已被用于臨床前或臨床研究檢測(cè)腫瘤或監(jiān)測(cè)腫瘤治療效果。Sano 等［30］用18F-FDG PET 在PIT 介入治療小鼠前后監(jiān)測(cè)了其在腫瘤萎縮前的急性細(xì)胞毒作用。體內(nèi)18F-FDG PET 成像顯示，PIT 治療后75 min 時(shí)在治療的腫瘤內(nèi)放射性累積降低了76%，且維持24 h。而非治療組的腫瘤無(wú)任何變化，且各組腫瘤的大小均無(wú)變化。因此，PIT 引起的即時(shí)細(xì)胞毒作用能夠通過(guò)葡萄糖攝取的下降而被檢測(cè)到，且該現(xiàn)象比腫瘤萎縮的發(fā)生早很多。

4.3.2 熒光壽命（fluorescence lifetime，F(xiàn)LT） 熒光蛋白（fluorescent protein，F(xiàn)P）是監(jiān)測(cè)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的潛在替代方法。但是，不管細(xì)胞存活與否，F(xiàn)P都會(huì)保留其信號(hào)，甚至在壞死細(xì)胞中也可能被巨噬細(xì)胞吸收。因此，使用FP 的熒光成像更適合于縱向監(jiān)測(cè)光療的效果。盡管IR700 具有熒光且能反映腫瘤的負(fù)荷，但在溶酶體中分解代謝和光漂白后，熒光可能會(huì)減少，從而導(dǎo)致難以準(zhǔn)確判斷組織活力。所以，F(xiàn)P 與IR700 的熒光均不適合表征PIT 的療效。而FLT 是一個(gè)可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)，它不依賴于APC（如Pan-IR700）的濃度或溶液中的曝光量，似乎只有周圍的化學(xué)微環(huán)境才會(huì)影響IR700的FLT。

IR700 的FLT 相對(duì)比較長(zhǎng)，因此其FLT 的變化可以是靶細(xì)胞死亡的很好的預(yù)測(cè)因子。隨著Pan-IR700 逐漸內(nèi)化到溶酶體中，IR700 的FLT 逐漸變長(zhǎng)且為孵育時(shí)間的函數(shù)（FLT 從孵育1 h 的2.98 ns延長(zhǎng)至孵育24 h 的3.42 ns）。當(dāng)暴露于閾值及以上的NIR 光時(shí)，Pan-IR700 引起的細(xì)胞膜和溶酶體膜的破壞導(dǎo)致IR700 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集并進(jìn)入細(xì)胞外空間，與此同時(shí)顯著降低了IR700 的FLT。因此，F(xiàn)LT 的縮短可以作為PIT 引起的急性膜損傷的指標(biāo)。體內(nèi)亦是如此，在單次有效劑量的NIR 光照射后30 min 內(nèi)，可觀察到體內(nèi)治療腫瘤的FLT縮短，它在腫瘤大小和形狀改變前幾天即顯示出生物學(xué)效應(yīng)。FLT能夠立即讀出腫瘤的狀態(tài)，在治療后可以立即評(píng)估PIT 對(duì)腫瘤細(xì)胞的治療效果，并幫助決定在治療過(guò)程中是否需要額外的光劑量［45］。

4.3.3 生物發(fā)光信號(hào) 螢光素酶-螢光素光子計(jì)數(shù)技術(shù)是在報(bào)告基因技術(shù)的幫助下開發(fā)的，已廣泛用于體內(nèi)外分子和細(xì)胞生物學(xué)。螢光素酶-螢光素光子計(jì)數(shù)成像最常見的報(bào)告基因是編碼螢火蟲螢光素酶的基因，該酶通過(guò)消耗三磷酸腺苷（ATP）、Mg2+和氧氣從而催化D-螢光素的氧化來(lái)發(fā)光。 該光子計(jì)數(shù)成像具有很高的腫瘤背景比（TBR），因此，靈敏度非常高。NIR-PIT 后熒光素酶 活 性 的 變 化 用% RLU （relative light units，RLU；%RLU=光照后RLU/光照前RLU×100）表示。與治療前相比，在PIT 后立即就可觀察到%RLU 下降了近一半，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)繼續(xù)逐漸下降，說(shuō)明細(xì)胞死亡仍在繼續(xù)。PIT 后30 min 的%RLU 顯著低于0 min，且PIT 后24 h 與48 h 的%RLU 又顯著低于30 min。NIR-PIT 誘導(dǎo)已治療腫瘤中ATP的快速釋放導(dǎo)致熒光素酶-熒光素光子計(jì)數(shù)的快速減少。因此，熒光素酶活性能夠反映NIR-PIT 早期與晚期腫瘤活力的降低，尤其適用于監(jiān)測(cè)NIR-PIT后急性期的腫瘤活力。但是，該技術(shù)的分辨率不高，現(xiàn)有技術(shù)還無(wú)法讓患者的腫瘤組織表達(dá)熒光素酶，故而尚不能轉(zhuǎn)化到臨床［46］。

5 總結(jié)與展望

NIR-PIT 在體內(nèi)外對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒，具有腫瘤細(xì)胞高度選擇性，能夠特異性地結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面，經(jīng)NIR 光照射引起細(xì)胞膜的破壞并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。借助光纖擴(kuò)散器、內(nèi)窺鏡、外部/間質(zhì)光源聯(lián)用等能將NIR 光傳遞至腫瘤深處，從而改善NIR 光的組織穿透性；借助風(fēng)冷或降低功率密度延長(zhǎng)照射時(shí)間可消除NIR-PIT 對(duì)照射部位的熱損傷；借助葡萄糖攝取、熒光壽命、生物發(fā)光信號(hào)等的變化可快速評(píng)價(jià)NIR-PIT 的治療效果。隨著研究的逐漸深入，NIR-PIT 有巨大的潛力成為臨床應(yīng)用廣泛的腫瘤治療手段。