劉媛媛，賀 朝

（1咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,咸陽712000；2陜西中醫(yī)藥大學(xué),咸陽712046）

木犀草素（luteolin，Lut）是從草本植物木犀草（Reseda alba L.）中提取分離得到的一種黃酮類化合物，已有研究表明，木犀草素具有消炎［1］、抗過敏［2］、抗腫瘤［3］、抗菌［4］等多種藥理學(xué)活性，隨著對木犀草素的抗菌、抗病毒活性研究深入，已證明其對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌等多種細(xì)菌和病毒具有抑制作用，其作用機(jī)制是通過抑制DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，進(jìn)而阻斷核酸mRNA 及蛋白質(zhì)的合成［5］，干擾細(xì)菌的分裂增殖。然而，木犀草素為水難溶性藥物（水中溶解度僅為6 μg/mL）［6］，不利于藥物滲透至細(xì)菌內(nèi)部，極大的降低了抑菌效果。為了提高木犀草素的溶解性，已將其制備成微乳［7］、聚合物膠束［8］、羥丙基-β-環(huán)糊精包合物［9］、磷脂復(fù)合物［10］等新型給藥系統(tǒng)。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLCs）是以一定比例的固態(tài)脂質(zhì)和液態(tài)脂質(zhì)作為基質(zhì)，將藥物包裹在納米載體內(nèi)核或吸附在其表面，構(gòu)成的新型藥物傳遞系統(tǒng)，與傳統(tǒng)載體相比，NLC 具有增加藥物溶解度及穩(wěn)定性，提高滲透性以及抗菌活性，延長作用時間，在抗菌藥物遞送系統(tǒng)中具有廣闊的應(yīng)用前景［11-12］。本研究將木犀草素制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，以提高藥物的溶解度和滲透性，為木犀草素局部外用給藥提供一種有效途徑。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

木犀草素原料藥（上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度：99.5%，批號：P006511）；單硬脂酸甘油酯（ 德國巴斯夫公司）；辛酸癸酸三甘油脂（Miglyol?812，嘉法獅上海貿(mào)易有限公司）；泊洛沙姆188（Lutrol?F68，德國巴斯夫公司）。

供試菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，革蘭陽性菌，ATCC 3101），大腸埃希菌（Escherichia coli，革蘭陰性菌，ATCC 8735）均由南京便診生物科技有限公司提供。

1.2 儀 器

LC-100 高效液相色譜系統(tǒng)（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；JY98-IIIDN超聲波粉碎機(jī)（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；CM-120 型透射電子顯微鏡（荷蘭Philips 公司）；Zetasizer Nano ZS 90 型激光粒度測定儀（英國Malvern 公司）；ZRD-1402DA 智能溶出度測試儀（北京北研科儀儀器有限責(zé)任公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；超濾管（截留相對分子質(zhì)量：100 kD，密理博中國有限公司）；纖維素透析袋（截留相對分子質(zhì)量：5 000～10 000 D，上海研拓生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 Lut-NLCs的制備

本研究以單硬脂酸甘油酯和Miglyol?812 分別作為固體脂質(zhì)和液體脂質(zhì)，以泊洛沙姆188作為表面活性劑，采用熱熔乳化輔助探頭超聲制備Lut-NLCs［13］。制備工藝如下：稱取處方量的單硬脂酸甘油酯和Miglyol?812加入到乙醇和丙酮的混合有機(jī)溶劑（1∶1）5 mL 中，溶解；將溶液放入到60 ℃水浴中保溫，呈透明狀溶液；稱取處方量木犀草素加入到上述脂質(zhì)溶液中，攪拌至藥物完全溶解；另稱取處方量泊洛沙姆188 加入到純化水50 mL 中，水浴加熱至60 ℃保溫，攪拌溶解，得到溶液澄清透明；在高速（3 000 r/min）磁力攪拌下，將含藥有機(jī)相快速加入到泊洛沙姆188水溶液中，分散形成黃色乳狀溶液，保持60 ℃水浴溫度，持續(xù)高速攪拌30 min，揮干有機(jī)溶劑，并向乳狀液中補(bǔ)加同溫度純化水至50 mL；使用探頭超聲以400 W 超聲功率處理乳液，超聲頻率為：超聲5 s，間隔5 s，持續(xù)超聲5 min；超聲結(jié)束后迅速將乳狀液放入到冰水浴中冷卻，經(jīng)0.8 μm 濾膜過濾，即得到外觀呈黃色帶有乳光的Lut-NLCs，放置到4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 粒徑測定

采用激光粒度測定儀粒度儀測量Lut-NLCs 的粒徑分布。使用移液槍移取Lut-NLCs 0.2 mL，加入蒸餾水5 mL稀釋，輕輕振搖，取少量稀釋液加入到直徑為1 cm 的石英樣品池中，放入到激光粒度測定儀中檢測粒徑分布，樣品測定參數(shù)為：溫度為25 ℃，He-Ne 激光器，功率為4 mW，檢測波長為632.8 nm，散射角為90°。每個樣品平行測定3次，取平均值。

2.3 包封率測定

本研究采用超濾離心法測定Lut-NLCs 的包封率［6］。精密移取Lut-NLCs 樣品0.5 mL 加入到超濾離心管（截留相對分子質(zhì)量：100 kD）上腔中，在4 500 r/min 下離心40 min，收集超濾液，將所得的超濾液全部轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，采用HPLC 法測定藥物含量，并計算得到Lut-NLCs 中游離藥物濃度（cfree）；另取同一批Lut-NLCs 樣品0.5 mL 加入到100 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC 法測定藥物含量，并計算得到Lut-NLCs 中總藥物濃度（ctotal），參照以下公式計算Lut-NLCs 的包封率。每個樣品平行測定3 次，取平均值。 EE=（1 - cfree/ctotal）×100%。 測定Lut-NLCs 的包封率色譜條件［6］如下：色譜柱為Dikma Diamasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為350 nm，流動相為甲醇-水-乙酸（60∶40∶2），流速為1.0 mL/min。系統(tǒng)適用性結(jié)果顯，在該色譜條件下輔料不干擾藥物測定，色譜峰理論塔板數(shù)不低于6 000，拖尾因子在0.95～1.05 內(nèi)；Lut 在質(zhì)量濃度在0.5～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，回歸方程為A=36 984.3c - 1 253.6（r=0.999 9），進(jìn)樣精密度RSD 為0.5%（n=6），加樣回收率平均值（100.5±0.3）%（n=9），驗證結(jié)果顯示，在該色譜條件適合Lut-NLCs的包封率測定。

2.4 Box-Behnken實驗設(shè)計優(yōu)化Lut-NLCs的處方

通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，固體脂質(zhì)單硬脂酸甘油酯濃度、液體脂質(zhì)Miglyol?812 濃度和表面活性劑泊洛沙姆188 濃度是影響Lut-NLCs 的粒徑分布和包封率的主要因素。因此，本研究采用Box-Behnken實驗設(shè)計系統(tǒng)研究了這3 個關(guān)鍵處方變量對粒徑分布和包封效率的影響。根據(jù)初步實驗篩選結(jié)果確定3 個變量的濃度范圍，即固體脂質(zhì)濃度（X1）為10.0～30.0 mg/mL，液體脂質(zhì)濃度（X2）為5.0～15.0 mg/mL，表面活性劑濃度（X3）為5.0～25.0 mg/mL，實驗設(shè)計變量信息見表1。

Table 1 Variable levels of Box-Behnken experiment design

2.5 微觀形態(tài)觀察

通過透射電子顯微鏡觀察Lut-NLCs 的微觀形態(tài)。取一滴Lut-NLCs 樣品溶液鋪展在200 目的銅網(wǎng)格涂層上，并用濾紙除去多余的水分，待水分揮干后，向銅網(wǎng)格表面滴加0.05 g/mL 磷鎢酸溶液，負(fù)染10 min，室溫環(huán)境中風(fēng)干，將樣品放置在透射電子顯微鏡下觀察并拍攝電鏡照片。

2.6 體外釋藥行為研究

取含有吐溫-80（0.5%）的pH 7.4 磷酸鹽緩沖液100 mL 加入到500 mL 燒杯中，水浴溫度為32 ℃，對Lut-NLCs 體外藥物釋放行為進(jìn)行考察。精密移取Lut-NLCs 5 mL 轉(zhuǎn)移到透析袋（截留相對分子質(zhì)量：5～10 kD）中，系緊兩端，放入到燒杯中，另將一支長度為2.5 cm，直徑為0.5 cm 圓柱形磁力攪拌子放入燒杯中，封口膜密封。開啟磁力攪拌，攪拌速為100 r/min，在預(yù)定的時間間隔內(nèi)從燒杯中取出溶出介質(zhì)（同時補(bǔ)加等溫等體積介質(zhì)溶液）2 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾；同法，取Lut原料藥DMSO 溶液（藥物質(zhì)量濃度為5 mg/mL）按照上述方法操作。采用HPLC 法測定藥物釋放含量，計算Lut-NLCs 和Lut 溶液的藥物累積釋放度，繪制藥物釋放度-時間曲線。測定Lut-NLCs 中藥物釋放的含量色譜條件［6］如下：色譜柱為Dikma Diamasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為350 nm，流動相為甲醇-水-乙酸（60∶40∶2），流速為1.0 mL/min。系統(tǒng)適用性結(jié)果顯示，在該色譜條件下釋放介質(zhì)中吐溫-80 不干擾藥物測定；Lut 在質(zhì)量濃度在0.1～40.0 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，回歸方程為A=35 452.7c - 1 586.2（r=0.999 8），進(jìn)樣精密度RSD 為0.7%（n=6），加樣回收率平均值（99.6 ± 0.4）%（n=9），驗證結(jié)果顯示在該色譜條件適合Lut-NLCs的釋放度測定。

2.7 體外抑菌實驗

通過抑菌圈實驗比較Lut 原料藥和Lut-NLCs的對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的體外抑菌效果。分別取濃度為每毫升1×105CFU 金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌菌液各200 μL均勻的接種到鋪有培養(yǎng)基的表面皿中，做上標(biāo)記，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在每份培養(yǎng)基上均取直徑為5 mm小孔，各3 個，分別將Lut 原料藥（使用DMSO 溶解［14］）和Lut-NLCs 加入到小孔內(nèi)（給藥劑量相同，均為每孔50 μg），放到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑，取平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 模型選擇

使用Box-Behnken 實驗設(shè)計優(yōu)化了Lut-NLCs的處方，共進(jìn)行15次實驗，實驗結(jié)果見表2。

通過Box-Behnken實驗設(shè)計軟件對表2數(shù)據(jù)處理得到模型評價結(jié)果（表3），建議Y1和Y2均選用多元二次模型（Quadratic vs 2FI）擬合。

3.2 數(shù)據(jù)方差分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件對表2中的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計分析結(jié)果分別見表3和表4，Y1和Y2的擬合多元二次方程模型P 值分別為0.000 1和0.000 2，均極為顯著（P ＜0.01）；Y1和Y2兩個模型的失擬項P分別為0.123 6和0.294 1，均不顯著（P ＞0.05），說明兩個模型的預(yù)測值與實際值之間的差異較小，可信度較好，可用于實驗優(yōu)化。經(jīng)統(tǒng)計軟件擬合得到的兩個多元二次方程為：

Table 2 Independent variables (X) and dependent variables (Y) in experiment design (xˉ± s, n = 3)

另外，統(tǒng)計分析結(jié)果（表5）表明，X1、X2、X1X2、X1X3、X12、X22、X32對Y1模型具有顯著性影響（P ＜0.05），Y1方程中X12、X22、X32前面系數(shù)為正值，表示對Y1模型具有協(xié)同作用，而Y1方程中X1、X2、X1X2、X1X3前面系數(shù)為負(fù)值，表示對Y1模型具有拮抗作用；同理，X1、X2、X1X2、X12、X22、X32對Y2具有顯著性影響（P＜0.05），Y2方程中X1、X2、X1X2前面系數(shù)為正值，表示對Y2模型具有協(xié)同作用，而Y2方程中X12、X22、X32前面系數(shù)為負(fù)值，表示對Y2模型具有拮抗作用。通過3D 響應(yīng)面圖可直觀解釋自變量與因變量之間的關(guān)系，見圖1，圖2。

Table 3 Summary of results of regression analysis for average particle size (Y1) and encapsulation efficiency (Y2) of Lut-NLCs

Table 4 Results obtained from ANOVA of Box-Behnken experiment design for optimization of average particle size (Y1) of Lut-NLCs

Table 5 Results obtained from ANOVA of Box-Behnken experiment design for optimization of encapsulation efficiency (Y2) of Lut-NLCs

曲面陡峭程度反映了因變量對自變量的敏感程度，當(dāng)曲面陡峭時說明自變量對因變量的變化敏感性較大，而當(dāng)曲面平坦時說明自變量對因變量的變化敏感性較小。由圖1可知，固體脂質(zhì)濃度和液體脂質(zhì)濃度對Lut-NLCs 的粒徑分布顯示出較為陡峭的曲面，即隨著固體脂質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，粒徑出現(xiàn)增大趨勢，隨著液體脂質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，粒徑出現(xiàn)減小趨勢，這是由于固體脂質(zhì)質(zhì)量濃度的增加（或液體脂質(zhì)質(zhì)量濃度的降低），導(dǎo)致體系的黏度增大，所得到的Lut-NLCs 粒徑較大；同樣，由圖2 可知，固體脂質(zhì)質(zhì)量濃度和液體脂質(zhì)質(zhì)量濃度對Lut-NLCs 的包封率顯示出較為陡峭的曲面，包封率隨著固體脂質(zhì)質(zhì)量濃度的增加而降低，隨著液體脂質(zhì)質(zhì)量濃度的增加而增大。

Figure 1 Response surface diagram of solid lipid concentration (X1)，liquid lipid concentration (X2) and surfactant concentration (X3) to the particle size distribution (Y1) of luteolin nanostructured lipid carriers (Lut-NLCs)

Figure 2 Response surface diagram of solid lipid concentration (X1)，liquid lipid concentration (X2) and surfactant concentration (X3) to the encapsulation efficiency (Y2) of Lut-NLCs

粒徑分布和包封率通常作為納米給藥系統(tǒng)的重要指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)化，本研究要求制備的Lut-NLCs 要求粒徑分布達(dá)到“最小值”，包封率達(dá)到“最大值”，通過實驗軟件對建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行綜合分析，得到Lut-NLCs 的最優(yōu)處方為：固體脂質(zhì)質(zhì)量濃度為18.0 mg/mL、液體脂質(zhì)質(zhì)量濃度為13.0 mg/mL，表面活性劑質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL，預(yù)測粒徑分布為206.0 nm，包封率為86.8%。按照最優(yōu)處方制備3 批Lut-NLCs 進(jìn)行驗證，測定3 批樣品粒徑的平均值為（210.4±17.3）nm，包封率為（88.4±1.2）%，實驗值與預(yù)測值相近，擬合的最優(yōu)處方可信度較高。

3.3 微觀形態(tài)觀察

通過透射電子顯微鏡可觀察到Lut-NLCs 為球狀或類球狀（圖3），表面光滑圓整，粒徑分布均勻，粒徑大約在200 nm分布。

Figure 3 Transmission electron micrograph of Lut-NLCs

3.4 溶出度研究

Lut-NLCs和Lut溶液的體外釋放曲線如圖4所示，可以看出Lut 溶液在2 h 內(nèi)藥物可達(dá)到完全釋放；而Lut-NLCs 在最初的2 h 內(nèi)藥物快速釋放，超過40% 的藥物從納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中釋放出來，推測一部分藥物吸附在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體表面，導(dǎo)致初始階段藥物呈爆發(fā)式釋放，這種條件下有利于藥物迅速達(dá)到抑菌濃度，快速抑制細(xì)菌增殖；在后期藥物釋放較為緩慢，在12 h 藥物釋放達(dá)到95%，這部分藥物推測是通過擴(kuò)散或脂質(zhì)材料溶蝕的方式釋放，后期的這種藥物平穩(wěn)緩慢釋放可以維持穩(wěn)定抑菌濃度，能夠起到長效抑菌。

Figure 4 In vitro drug release rate of Lut-NLCs and Lut-solution (xˉ±s, n = 6)

3.5 體外抑菌實驗

實驗結(jié)果顯示，Lut 原料藥和Lut-NLCs 的對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有抑菌效果，經(jīng)測定Lut 原料藥對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（16.7±0.8 mm）（圖5-A），對大埃希菌的抑菌圈直徑為（14.9±0.4 mm）（圖5-C），而Lut-NLCs 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（22.6±0.9 mm）（圖5-B），對大腸埃希菌的抑菌圈直徑為（24.1±0.8 mm）（圖5-D），說明Lut-NLCs 對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果優(yōu)于Lut原料藥。

Figure 5 Inhibition zones of Lut APIs and Lut-NLCs against Staphylococcus aureus (A/B) and Escherichia coli (C/D)

4 討 論

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備工藝包括：高壓均質(zhì)法、溶劑擴(kuò)散法、微乳法、超聲法、乳化蒸發(fā)-低溫固化法、熱熔乳化-超聲法等［15］，其中熱熔乳化-超聲法是制備納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的常用方法，該制備工藝是將熱熔狀態(tài)下的混合脂質(zhì)（包含藥物）油溶液加入到含有表面活性劑的水溶液中，形成初乳液，再將該溶液通過探頭超聲處理即可得到一定粒徑大小的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。熱熔乳化-超聲法與其他制備工藝相比，具有制備工藝簡單，對設(shè)備要求不高、實驗重復(fù)性良好等優(yōu)點，因此本研究采用熱熔乳化-超聲法制備Lut-NLCs。

藥物在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中的包載方式分為吸附和包裹兩種，其不同的包載方式?jīng)Q定其在體外的釋藥行為；吸附在表面的藥物主要聚集在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體外周的表面活性劑中，在前期出現(xiàn)暴釋現(xiàn)象；包裹在內(nèi)部的藥物主要包封在缺陷性結(jié)晶和脂質(zhì)層中，在釋藥后期通過脂質(zhì)溶蝕將藥物釋放出來，表現(xiàn)為后期釋藥平穩(wěn)、緩慢。

本研究為了提高木犀草素的溶解性及滲透性，將其制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并通過抑菌圈實驗證明Lut-NLCs 對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果均高于原料藥。這可能是由于Lut-NLCs的粒徑極其微小，比表面積巨大，能夠有效的吸附到細(xì)菌表面［16］，且納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的外表面被泊洛沙姆188 所包裹，具有較強(qiáng)的親水性，與細(xì)菌接觸后能夠滲透到細(xì)菌細(xì)胞壁中，改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞壁的滲透性［17］，有助于Lut-NLCs迅速進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，達(dá)到更好的抑菌效果。