張 迪,冉冬芝,余 瑜,甘宗捷*
(1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶400016;2重慶食品藥品檢驗檢測研究院,重慶401121)
間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)屬于胰島素受體(insulin receptor,IR)超家族,是一種高度保守的受體型酪氨酸激酶。在成人中,ALK 主要在神經(jīng)系統(tǒng),睪丸和小腸中表達并參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的功能和發(fā)育[1]。然而,已有研究表明,ALK 的異常表達如基因突變、重排及擴增與多種人類惡性腫瘤如神經(jīng)母細胞瘤、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、卵巢癌等密切相關(guān)[2]。例如在NSCLC 中,即檢測到約3%~7% 的NSCLC 患者伴有ALK 與棘皮動物微管結(jié)合蛋白4(Echinoderm micro tubuleassociated protein-like 4,EML4)的基因融合突變[3],而該融合基因編碼形成的EML4-ALK 嵌合蛋白會導(dǎo)致ALK二聚化,從而激活A(yù)LK 及其下游RAS/MEK/ERK 以及JAKs/STAT3 等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進細胞的快速增殖與分化,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。因此,EML4-ALK 融合基因突變(也稱為ALK 陽性突變)已被證明是導(dǎo)致NSCLC 的重要驅(qū)動基因突變之一,針對該靶點的ALK 抑制劑的研發(fā)一直是當(dāng)前熱點之一[5-6]。
近年來,全球已研發(fā)出不少針對ALK 的小分子靶向藥物,其中,2011 年上市的克唑替尼(crizotinib)是治療ALK 依賴的NSCLC 的第1 個ALK 抑制劑[7],也是目前NSCLC 伴ALK 陽性患者公認(rèn)的一線用藥,但是由于EML4-ALK 融合蛋白ATP 口袋附近發(fā)生的基因突變、基因擴增以及信號通路的旁路激活等因素影響,絕大部分患者在使用克唑替尼約8~12 個月后即出現(xiàn)耐藥[8],限制了克唑替尼的臨床使用。因此,針對克唑替尼的耐藥,又開發(fā)了對ALK 激酶專屬性和親和力更強的第2 代ALK 抑制劑色瑞替尼(ceritinib),阿來替尼(alectinib),布格替尼(brigatinib)和第3 代ALK 抑制劑洛拉替尼(lorlatinib)。然而,盡管色瑞替尼、阿來替尼等第2 代ALK 抑制劑能夠克服克唑替尼的耐藥性,但是長期使用之后也會由于多種原因不可避免的獲得性耐藥[9]。即使是第3 代ALK 抑制劑洛拉替尼在臨床使用過程中也被指出存在有耐藥性問題[10]。因此,ALK 抑制劑的耐藥問題,嚴(yán)重影響了其在臨床上的應(yīng)用。
目前公認(rèn)的ALK 抑制劑的耐藥主要包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥,原發(fā)性耐藥機制目前尚不明確,初步認(rèn)為與腫瘤內(nèi)在因素或患者/藥物特異性因素有關(guān)[11]。而獲得性耐藥產(chǎn)生的機制則主要包括ALK依賴型和ALK非依賴型耐藥[11-13]。
該機制已被證明與多種激酶類藥物耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)[14],其機制主要是因為激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的二次基因突變導(dǎo)致激酶與藥物結(jié)合區(qū)的空間構(gòu)象發(fā)生改變或者增強激酶與ATP 的結(jié)合力,從而會影響藥物與激酶的結(jié)合,致使耐藥性的產(chǎn)生。研究表明,約有20%~30% 的克唑替尼耐藥患者體內(nèi)能夠檢測到二次基因突變,而在第2代ALK抑制劑耐藥的NSCLC 患者中,基因突變率更是超過了50%[12],因而二次基因突變已成為NSCLC 腫瘤細胞對第1代、第2代ALK抑制劑耐藥的主要原因。
不同ALK 抑制劑誘發(fā)的二次突變區(qū)不甚相同,比如在克唑替尼耐藥的患者中觀察到,ALK 激酶域中位于ATP 結(jié)合口袋底部的亮氨酸殘基L1196,會突變?yōu)榈鞍彼幔∕et),蛋氨酸更長的硫醚側(cè)鏈會增加空間位阻,從而阻礙了克唑替尼與ALK 激酶的結(jié)合,該突變也被稱為L1196M“守門員”突變。此外,位于ATP 結(jié)合區(qū)的甘氨酸殘基會點突變?yōu)槲蛔韪蟮睦i氨酸,該突變(G1269A)也是引起克唑替尼耐藥的主要突變之一[15]。而對于第2 代ALK 抑制劑(如色瑞替尼、阿來替尼等),突變則主要發(fā)生在溶劑前沿區(qū)和αC 螺旋的碳末端區(qū),比如G1202R、F1174L 突變等(圖1-A)[9]。其中,甘氨酸殘基突變?yōu)轶w積更大的精氨酸的G1202R溶劑區(qū)突變是第2代ALK抑制劑最常見的基因突變之一,占35%~60%。該突變會引起色瑞替尼和阿來替尼結(jié)構(gòu)中的哌啶環(huán)與激酶的結(jié)合障礙(圖1-B,圖1-C)[16],而F1174 突變則會促進ALK活化構(gòu)象的產(chǎn)生,二者均不利于第2 代抑制劑與ALK的結(jié)合,最終導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[17]。
圖1 第1代、第2代ALK抑制劑誘發(fā)的常見二次基因突變A:各種基因突變的頻率[9];B:阿來替尼與ALKwt(PDB:3AOX)的共晶結(jié)合模式圖;C:阿來替尼與ALK G1202R突變體的共晶結(jié)合模式圖[16]
ALK 擴增目前僅在少部分克唑替尼耐藥的患者發(fā)現(xiàn),而且擴增的發(fā)生頻率遠低于二次突變,因此目前在臨床上,基因擴增已不被認(rèn)為是導(dǎo)致第2代及其之后開發(fā)的ALK 抑制劑的主要耐藥機制[15,18]。
當(dāng)ALK 的信號通路被抑制之后,與其密切關(guān)聯(lián)的其他腫瘤蛋白信號通路(如EGFR、KIT、IGF1R 等)會因為反饋機制而補償性激活[13]。比如,在克唑替尼耐藥的細胞株上,就發(fā)現(xiàn)了表皮生長 因 子 受 體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的異常磷酸化,其下游信號ERK 和Akt 也出現(xiàn)了異?;罨蚨[瘤細胞即使在ALK 通路被阻滯之后,仍然可以繼續(xù)增生與分化,繼而導(dǎo)致了腫瘤對克唑替尼耐藥[19]。
腫瘤細胞表型的改變比如EMT 會使腫瘤細胞獲得間質(zhì)形態(tài)并具有遷移和侵襲能力,這也被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移以及產(chǎn)生耐藥的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)[20],在多種ALK 抑制劑耐藥肺癌細胞中可以觀察到與EMT 密切相關(guān)的間質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白(VIM)的表達上調(diào),而上皮標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白會下調(diào)甚至消失,說明耐藥的產(chǎn)生與EMT 有一定關(guān)聯(lián)。
除了以上幾種耐藥機制,藥物轉(zhuǎn)運蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein)的過度表達導(dǎo)致的藥物外排增加,從而使中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)藥物暴露量低引起ALK 抑制劑的耐藥也有文獻報道[21]。因此,針對ALK 抑制劑的耐藥機制,臨床上發(fā)展了多種策略來克服ALK 抑制劑出現(xiàn)的耐藥性問題,并在一定程度上取得了積極的效果。
不同抗腫瘤藥物的合理聯(lián)用是目前臨床上克服腫瘤耐藥性的一種常用手段和方法[22-23]。目前已報道可以通過將ALK 抑制劑與多種其他靶點的抗腫瘤藥物聯(lián)用來克服其存在的耐藥性問題。
3.1.1 與Hsp90 抑制劑聯(lián)用 研究表明,EML4-ALK 融合蛋白是熱休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)高度敏感的客戶蛋白,干擾該分子伴侶蛋白功能可以有效地降低EML-ALK 的表達并抑制ALK 的 激 酶 活 性[24]。 因 此,ALK 抑 制 劑 與Hsp90 抑制劑具有潛在的協(xié)同作用。Sang 等[25]就在體內(nèi)和體外證實了將Hsp90 抑制劑Ganetespib與克唑替尼合用,可以表現(xiàn)出優(yōu)于克唑替尼的抗腫瘤活性,而且對多種耐藥細胞如非小細胞肺癌H3122 克唑替尼耐藥細胞株,NB-39-nu 神經(jīng)母細胞瘤細胞(ALK 擴增型)表現(xiàn)出更強的耐受性和抑制活性。 目前,克唑替尼與Hsp90 抑制劑Onalespib 的聯(lián)合用藥已進入Ⅱ期臨床研究(NCT01712217),主要用于NSCLC 的治療[26]。因此,與Hsp90 抑制劑合用是治療多種ALK 驅(qū)動的惡性腫瘤的潛在有效策略。
3.1.2 與HDAC 抑制劑聯(lián)用 2018 年,Yun 等[27]的團隊從表觀遺傳學(xué)的角度報道了色瑞替尼的獲得性耐藥產(chǎn)生的作用機制,同時他們也發(fā)現(xiàn),當(dāng)色瑞替尼與組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor,HDACi)帕比司他(panobinostat)合用時,可以對AXL 受體的磷酸化及表達產(chǎn)生抑制作用,同時也會下調(diào)與EMT 密切相關(guān)的神經(jīng)-鈣黏素(CDH2)、波形蛋白的表達,通過以上協(xié)同作用,增強了色瑞替尼對耐藥細胞的敏感性及抑制活性,使其對H3122 耐藥細胞株及其體內(nèi)小鼠移植瘤產(chǎn)生了強效的抑制作用,最終達到逆轉(zhuǎn)耐藥的目的。此外,F(xiàn)ukada 等[28]也開展了類似的研究工作,他們也發(fā)現(xiàn)HDAC 抑制劑Quisinostat 可以使克唑替尼對耐藥細胞重新敏感。Shen 等[29]發(fā)現(xiàn)HDAC8 亞型抑制劑PCI-34051 與克唑替尼合用可以有效殺死ALK 野生型、ALK 擴增型、ALKF1174L突變型等神經(jīng)母細胞瘤細胞株。
3.1.3 與CDK 抑制劑聯(lián)用 細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)是多種細胞周期進程的主要調(diào)節(jié)因子,它能與相應(yīng)的調(diào)節(jié)亞基細胞周期蛋白(cyclin)結(jié)合形成有活性的二聚體,參與細胞周期的調(diào)節(jié)[30]。前期研究表明[31],ALK 抑制劑和CDK 抑制劑聯(lián)用可以協(xié)同降低兩條信號通路中p-ALK 和p-Rb 的表達,增強ALK 抑制劑對ALK 的抑制活性及對耐藥腫瘤細胞的敏感性,比如在ALK-F1174L 和F1245C 這兩種全新耐藥突變的異種神經(jīng)母細胞瘤模型上,即發(fā)現(xiàn)CDK4/6 的雙重抑制劑瑞博西尼(ribociclib)和ALK 抑制劑色瑞替尼的組合用藥會顯示出更高的細胞毒性和協(xié)同作用。與單用這兩種藥物相比,聯(lián)合治療可增強生長抑制、細胞周期阻滯和促進細胞死亡,并阻止耐藥性的出現(xiàn)。
3.1.4 與EGFR 抑制劑聯(lián)用 EGFR 通路的異常激活是導(dǎo)致腫瘤耐藥的重要機制之一。在多種ALK 抑制劑耐藥細胞株及患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞中的NGR1-HER3-EGFR 這條信號通路被代償性激活,因而腫瘤細胞即使在ALK 信號通路被阻斷之后仍可以通過其他信號通路增生分化,繼而對ALK 抑制劑產(chǎn)生了耐藥[32]。因此,與EGFR抑制劑合用則可以同時阻斷這兩條信號通路,從而協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用,提高治療效果。例如EGFR 抑制劑阿法替尼(afatinib)與色瑞替尼或者阿來替尼合用,就可以對H3122 色瑞替尼耐藥細胞株產(chǎn)生強效抑制作用[36]。此外,在同時具有ALK和EGFR 突變的NSCLC 患者體內(nèi)也觀察到,在使用EGFR 抑制劑厄洛替尼(erlotinib)治療后,可以使腫瘤細胞對ALK抑制劑也產(chǎn)生部分響應(yīng)[33]。
3.1.5 與PD-1抑制劑聯(lián)用 最近幾年,免疫治療已成為抗腫瘤藥物的研究熱點。研究表明,如果EML4-ALK融合蛋白過表達,會在缺氧或者有氧狀態(tài)下通過介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活蛋白STAT3 的上調(diào),增加程序性死亡受體配體1(programmed death ligand-1,PD-L1)的表達,從而導(dǎo)致T 細胞抑制,致使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[34]。因而ALK 抑制劑和PD-1/PD-L1 抑制劑聯(lián)用,已被認(rèn)為是治療NSCLC 特別是耐藥型NSCLC的一種新選擇[35]。目前,多種PD-1/PD-L1 抑制劑如納武單抗(nivolumab)和Avelumab 與ALK 抑制劑合用來治療進展性NSCLC 已進入臨床研究(NCT02393625,NCT02584634)[36]。
3.2.1 第4 代ALK 抑制劑 Repotrectinib(TPX-0005),是由美國TP Therapeutics 公司研發(fā)的一種具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的ALK/ROS1/TRK/SRC 小分子抑制劑,也被譽為第4 代ALK 抑制劑[37]。研究表明,Repotrectinib 對多種第1 代、第2 代ALK 抑制劑產(chǎn)生的耐藥突變?nèi)鏛1196M 和G1202R 等有效,抑制野生型、L1196M 突變型和G1202R 突變型ALK的親和力分別為0.87,0.65 和0.81 nmol/L,對野生型ALK 的抑制活性強于克唑替尼,對G1202R 突變型ALK 的抑制活性也強于所有第2 代ALK 抑制劑。Ba/F3 細胞增殖實驗也驗證了TPX-0005 對各種突變型細胞株具有強效的抑制活性(野生型IC5021.1 nmol/L,L1196M 50 nmol/L 和G1202R 20.5 nmol/L)[38],而且,Repotrectinib 對克唑替尼難治性并且有腦轉(zhuǎn)移的NSCLC 也已被證明了有效[37]。研究表明,Repotrectinib 克服耐藥的主要機制是通過抑制SRC/FAK 信號通路,繼而抑制腫瘤轉(zhuǎn)錄因子YB-1 的磷酸化,導(dǎo)致EGFR、CD44 和波形蛋白的表達下調(diào),最終從多個角度阻礙腫瘤細胞的增生、分化和遷徙[39]。此外,由于其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以直接與ATP 結(jié)合區(qū)結(jié)合,而不與溶劑區(qū)發(fā)生作用,因而可以有效克服G1202R 等一系列突 變[37]。 目 前Repotrectinib 治 療ROS1、NTRK、ALK 融合實體瘤的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究正在進行中,登記號NCT03093116,結(jié)果令人期待。
3.2.2 Type-Ⅱ型ALK 抑制劑 酪氨酸激酶的晶體結(jié)構(gòu)表明,幾乎所有酪氨酸激酶都具有相似的催化結(jié)構(gòu)域。其中,在ATP 結(jié)合位點附近,有一段由3 個氨基酸形成的保守活性鏈段序列,天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(Asp-Phe-Gly,DFG)。DFG 的構(gòu)象非常關(guān)鍵,當(dāng)Asp處于ATP結(jié)合位點附近的疏水腔外時,激酶處于活性構(gòu)象(DFG-in),而當(dāng)其位于激酶的內(nèi)部時,激酶則處于非活性構(gòu)象(DFGout)[40]。因此,根據(jù)激酶是否處于活性構(gòu)像,可以將與其結(jié)合的抑制劑主要分為:Type-Ⅰ型和Type-Ⅱ型[41]。其中Type-Ⅰ型是指在激酶處于DFG-in構(gòu)象時,與其ATP 口袋結(jié)合的抑制劑,主要屬于ATP競爭性的抑制劑。而Type-Ⅱ型則是指在激酶處于非活性構(gòu)象(DFG-out)時,主要與其變構(gòu)位點發(fā)生結(jié)合的抑制劑。此外,還有一種Type-Ⅰ1/2型抑制劑,是指在激酶處于活化構(gòu)象時,同時也可與Ⅱ型抑制劑主要結(jié)合部位發(fā)生結(jié)合的抑制劑。根據(jù)定義,前期開發(fā)的第1 代、第2 代抑制劑均屬于Type-Ⅰ型或Type-Ⅰ1/2 型抑制劑[42]。 由于Type-Ⅰ型抑制劑主要與ATP 區(qū)域的位點結(jié)合,而該位點處的氨基酸序列高度保守,導(dǎo)致此類抑制劑容易產(chǎn)生耐藥性。而Type-Ⅱ型抑制劑則未完全與ATP 結(jié)合位點發(fā)生結(jié)合,因而雖然其對激酶的親和力弱于Ⅰ型抑制劑,但是這也提高了它們對激酶的選擇性,并且降低了耐藥潛力[43],因此開發(fā)Type-Ⅱ型抑制劑也成為了獲得不易產(chǎn)生耐藥的抗腫瘤藥物的新選擇。Tu等[44]就首次報道了一類新型的以吡唑胺為母核的Type-Ⅱ型ALK 抑制劑,其中化合物5a 對ALK 的體外抑制活性最強(IC50=177 nmol/L)。通過共晶結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)(圖2),5a結(jié)構(gòu)中的5-氨基吡唑環(huán)仍可以與ALK 的鉸鏈區(qū)形成氫鍵。但與克唑替尼不同的是,其結(jié)構(gòu)中的丁基異唑脲基團會伸展到變構(gòu)口袋中與變構(gòu)位點結(jié)合,從而誘導(dǎo)ALK 構(gòu)象發(fā)生變化,最終表現(xiàn)出與克唑替尼不同的ALK 結(jié)合模式。 該項工作將為Type-Ⅱ型ALK抑制劑的開發(fā)提供重要思路。
圖2 化合物5a(黃色)、克唑替尼(藍色)與ALK的共晶復(fù)合物疊合圖(PDB:2XP2)[44]
3.2.3 其他新型的ALK 抑制劑 為了克服耐藥,研究者也設(shè)計合成了一些新型的小分子抑制劑。比如針對G1202R 激酶區(qū)突變導(dǎo)致的耐藥,Mathi等[45]和Geng 等[46]用空間位阻更小的基團如柔性的脂肪胺或者甘氨酸側(cè)鏈替換了色瑞替尼結(jié)構(gòu)中的哌啶環(huán)(化合物10 與12d),增強了化合物與G1202R 突變型ALK 激酶的結(jié)合力,增加了療效,并在一定程度上克服了耐藥性。另外,鑒于EGFR與ALK 抑制劑的協(xié)同作用,Chen 等[47]也報道了一種ALK/EGFR 雙重抑制劑CHMFL-ALK/EGFR-050,該化合物在體內(nèi)外展現(xiàn)了強效的腫瘤抑制活性。同時,CEP-37440[48],一種ALK/FAK 雙靶點抑制劑,也被證實對各種突變型的ALK 激酶均有效,而且該化合物具有更好的腦內(nèi)藥物暴露量,可能對腦轉(zhuǎn)移的腫瘤患者具有潛在的治療優(yōu)勢,目前該化合物已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床研究。
蛋白降解靶向嵌合體(proteolytic targeting chimera,PROTAC)是一類能夠通過誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化而導(dǎo)致靶蛋白降解的化合物。PROTAC技術(shù)作為新興的藥物研發(fā)技術(shù),已成為目前腫瘤治療領(lǐng)域的研發(fā)熱點。研究表明,通過設(shè)計合適的PROTAC 分子可以在一定程度上克服小分子抑制劑的缺陷(例如耐藥)[49]。最近,也報道了許多以ALK 為靶蛋白的PROTAC 分子。2018年,Zhang 等[50]以色瑞替尼作為ALK 配體,PEG 作為連接鏈,來拿度胺作為E3 連接酶配體,報道了ALK 的PROTAC 分子MS4077,結(jié)果顯示該分子可以以濃度和時間依賴的方式降低SU-DHL-1 淋巴癌和NCI-H2228 肺癌細胞中的ALK 融合蛋白水平。隨后,Kang等[51]以VHL 配體替換CRBN 配體,獲得了新型的ALK PROTAC 分子TD-004。藥理結(jié)果表明,TD-004 可以誘導(dǎo)ALK 降解,抑制ALK 融合陽性細胞系SU-DHL-1 和H3122,同時還能有效抑制H3122 異種移植瘤的生長。但需要注意的是,雖然ALK 的PROTAC 分子已有部分報道,并取得了一定進展,但這些分子對耐藥細胞的作用還有待進一步檢驗。
ALK抑制劑作為目前ALK陽性NSCLC的主要治療藥物,改善了NSCLC 的治療模式,延長了廣大病患的總生存期和無進展生存期,取得了良好的治療效果。但是,原發(fā)性或獲得性耐藥的發(fā)生,使其在臨床上的應(yīng)用也受到了明顯的限制。近年來,隨著二次基因突變、旁路激活、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等耐藥機制的不斷明析,已逐漸開發(fā)出針對這些耐藥機制的多種治療策略。例如,設(shè)計開發(fā)出可以克服基因突變的新1 代ALK 抑制劑或者將ALK抑制劑與多種化療藥物或免疫治療藥物聯(lián)用。此外,利用PROTAC 技術(shù)開發(fā)的靶向蛋白降解藥物在解決耐藥問題方面的潛力也備受關(guān)注。然而,雖然這些策略在一定程度上改善了ALK 抑制劑的治療效果,但均存在著或多或少的不足,比如新型的ALK 抑制劑的研發(fā)周期過長、投入大,不能立即滿足臨床的迫切需求,而聯(lián)合用藥導(dǎo)致的不同藥物之間潛在的相互作用以及藥代動力學(xué)性質(zhì)差異等問題,不僅會降低療效,而且可能會增強毒性。另外,PROTAC 藥物分子結(jié)構(gòu)過大,水溶性和PK/PD性質(zhì)不佳,脫靶毒性嚴(yán)重等,也制約著該技術(shù)的進一步應(yīng)用。因此,如何解決現(xiàn)有的關(guān)鍵問題,將很有可能是未來的研究熱點和方向。