李志英，段亞琴，張慧，雷嘉昕

(忻州師范學(xué)院 化學(xué)系，山西 忻州 034000)

碳量子點(diǎn)(CDs)是近幾年新發(fā)展起來的一種新型的碳納米材料，是熒光碳納米材料中最重要的一種，也稱為碳納米點(diǎn)、碳納米晶和碳點(diǎn)[1]，是尺寸在 10 nm 以下、單分散、幾何形狀近乎球型的碳納米功能材料.相對于傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)與有機(jī)染料，CDs粒徑小，水溶性好，化學(xué)惰性高，易于功能化，耐光漂白，低毒性，并且具有良好的生物相容性[2].正是因?yàn)镃Ds的這些優(yōu)越的性質(zhì)，所以在生物以及藥物領(lǐng)域中的應(yīng)用才越來越廣泛[3-4].

溴代乙酰膽堿(ACH)是一種化學(xué)物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)中擔(dān)當(dāng)信使[5]，與睡眠、運(yùn)動、學(xué)習(xí)記憶有著密不可分的聯(lián)系，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對ACH的測定，常采用電化學(xué)檢測法[6-7]，此外還有放射免疫法、熒光分光光度法、高效液相色譜法和離子選擇性微電極法等[8].本實(shí)驗(yàn)以食用花椒制備的CDs為熒光探針，考察了不同條件下ACH對CDs熒光的增強(qiáng)作用，這種方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，可用于制備快速檢測生物體內(nèi)ACH的傳感器.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；島津UV2550紫外可見光譜儀(島津公司，蘇州)；島津RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津有限責(zé)任公司)；Tecnai G2 F205-TWIN透射電子顯微鏡(美國FEI公司)

溴代乙酰膽堿(ACH)溶液(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)：準(zhǔn)確稱取 0.022 6 g的ACH固體，用少量蒸餾水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得1×10-3mol/L的溶液備用；硫酸奎寧(上海躍騰生物科技發(fā)展有限公司)：稱取0.04 g硫酸奎寧于100 mL干燥的燒杯中，用0.050 mol/L硫酸溶解，定容至100 mL容量瓶得1×10-3mol/L硫酸奎寧以備用.牛奶、酸奶原液(蒙牛純牛奶，北京通州食品工業(yè)區(qū))，花椒(購于忻州市華美超市)，實(shí)驗(yàn)所用其他試劑為分析純，水為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CDs的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g研磨后的食用花椒粉放入坩堝中，然后控制烘箱溫度在200 ℃，加熱20 min，冷卻后用1 mol/L的NaOH溶液溶解，用蒸餾水定容至100 mL.

1.2.2 CDs的表征

將CDs溶液干燥后，用Tecnai G2 F205-TWIN透射電子顯微鏡進(jìn)行檢測.取制備好的CDs溶液 0.3 mL定容于25 mL比色管中.設(shè)定狹縫寬度為10 nm，熒光比色皿厚度為1 cm,于λex、λem分別為315、429 nm處測定熒光光譜.并以蒸餾水為空白對照，在200～400 nm下測定紫外光譜.

1.2.3 CDs熒光量子產(chǎn)率的計算[9]

取2支25 mL的比色管，1支加入0.3 mL CDs，另1只加入1×10-7mol/L的硫酸奎寧1 mL，定容，以蒸餾水為空白，利用紫外光譜儀，在波長320 nm下測定溶液的吸光度.然后調(diào)整熒光光譜儀狹縫寬度為10 nm，熒光比色皿厚度1 cm,于λex、λem分別為315、429 nm處分別測定溶液的熒光光譜.

所獲各參數(shù)代入量子產(chǎn)率公式中進(jìn)行熒光產(chǎn)率的計算，計算公式為

Yu=Ys×Fu/Fs×As/Au.

Yu——待測未知樣品的量子產(chǎn)率；Ys——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；Fu、Fs——待測樣、標(biāo)準(zhǔn)物稀釋液的積分熒光強(qiáng)度；As、Au——標(biāo)準(zhǔn)物、待測樣在激發(fā)波長處最大吸光度值.

1.2.4 CDs對ACH的檢測

取2支10 mL比色管，分別加入制備好的CDs 1 mL，β-環(huán)糊精(β-CD)溶液1 mL，其中1支試管加入適量一定濃度的ACH，加蒸餾水稀釋至10 mL，狹縫寬度10 nm，λex/λem=315/429 nm，利用熒光分光光度計測定CDs的熒光強(qiáng)度F0以及加入ACH體系的熒光強(qiáng)度F，并計算ΔF(ΔF=F-F0)值.

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs的表征

用普通微柵支持膜浸漬在CDs溶液中，放在紅燈下烘干后掃描CDs直徑的大小.分別配制1×10-4mol/L的ACH、CDs和CDs+ACH溶液，利用紫外可見光譜儀，石英比色皿厚度1 cm,在200～400 nm測定紫外吸收光譜.用熒光分光光度計，將狹縫寬度設(shè)為10 nm，在激發(fā)波長為315 nm和發(fā)射波長為429 nm處測定熒光光譜.

圖1可以看出制備的CDs為球形，粒徑大小為2～10 nm，碳點(diǎn)平均直徑為4.2 nm.從圖2中可以看出CDs和ACH在260 nm處沒有紫外吸收，二者混合后有紫外吸收，由圖3可知，ACH沒有熒光，CDs中加入ACH，體系的熒光會增強(qiáng)，表明ACH對CDs熒光具有增敏作用.

圖1 透視電子顯微鏡圖Fig.1 TEM images of CDs

圖2 ACH和CDs作用的紫外吸收光譜Fig.2 UV spectra of interaction of ACH and CDs

圖3 ACH和CDs作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of interaction of ACH and CDs

2.2 制備溫度和時間的選擇

稱取0.1 g食用花椒粉5份，置于烘箱中，將溫度分別控制在180、190、200、210、220 ℃，加熱20 min，冷卻后用1 mol/L的NaOH溶液溶解，用蒸餾水稀釋定容至100 mL.控制時間分別為5、10、15、20和25 min，按1.2.1的方法測定發(fā)射波長為429 nm時CDs熒光強(qiáng)度F0，確定CDs的制備溫度和時間，結(jié)果見圖4、5.

圖4 燒灼溫度對CDs熒光的影響Fig.4 Effect of cautery temperature on fluorescence of CDs

圖5 燒灼時間對CDs熒光的影響Fig.5 Effect of time of cautery on fluorescence of CDs

從圖4中可以看出，在200 ℃時，CDs的熒光強(qiáng)度最大，因此，200 ℃為CDs制備的最佳溫度.從圖5中可以看出，在200 ℃下加熱20 min時，熒光強(qiáng)度最大，所以20 min為最佳制備時間.

2.3 pH值和放置時間及修飾劑對量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響

取5支10 mL的比色管，分別依次加入制備好的CDs 和β-CD溶液各0.1 mL，加蒸餾水稀釋至10 mL，分別考察放置時間及修飾劑和pH值對CDs熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖6、7.

圖6 pH值對CDs穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on the fluorescence intensity of CDs

圖7 時間對CDs穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of placement time on the fluorescence intensity of CDs

由圖6可知，pH值為4～7時，CDs的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).原因可能是酸性條件下β-CD水解，保護(hù)作用減弱，熒光猝滅，且從數(shù)據(jù)可以看出pH在偏酸性時對體系影響較大，因此CDs的最佳pH值為7.從圖7可知，加入β-CD溶液0.1 mL后，放置時間對CDs的熒光強(qiáng)度的影響不大，比較穩(wěn)定.

2.4 CDs熒光量子產(chǎn)率的測定.

按1.2.3的方法測定，將測定的各參數(shù)代入量子產(chǎn)率計算公式，計算CDs熒光量子產(chǎn)率，計算結(jié)果見表1.

表1 熒光碳點(diǎn)的量子產(chǎn)率

2.5 CDs和不同物質(zhì)的響應(yīng)

圖8 CDs對不同物質(zhì)的響應(yīng)Fig.8 Response of CDs to different compounds

取13支10 mL的比色管，均加入CDs原液0.1 mL，除1號管外，其他各管加入1 mL，1×10-4mol/L各響應(yīng)物質(zhì)溶液(ACH,丙二醇，鹽酸普魯卡因，三聚氰胺，甲醛，賴氨酸，牛血清蛋白，水楊酸，對苯二胺，氯霉素，亞硝酸鹽，1-萘乙酸)，加蒸餾水稀釋至10 mL，室溫下反應(yīng)5 min，搖勻.將熒光分光光度計狹縫寬度設(shè)為10 nm，在λex/λem=315/429 nm處測定熒光強(qiáng)度.結(jié)果如圖8所示.由圖8可知，F(xiàn)/F0的巨大差異表明CDs對ACH具有良好選擇性.

2.6 測定體系的pH值和反應(yīng)時間的選擇

取5支10 mL的比色管，5支比色管中分別加入制備好的CDs 0.1 mL，將pH值調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，再分別依次加入1×10-3mol/L ACH 1 mL，定容，測定CDs 以及反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度F，試劑空白(未添加ACH)熒光強(qiáng)度為F0，計算ΔF(ΔF=F-F0)值.結(jié)果如圖9.同條件下測定反應(yīng)時間分別為5、10、15、20、25 min時的ΔF，結(jié)果見圖10.

圖10 反應(yīng)時間對熒光光譜的影響Fig.10 Effect of reaction time on fluorescence spectra

實(shí)驗(yàn)表明，調(diào)節(jié)pH值為7時，ΔF最大，從數(shù)據(jù)可以看出，pH偏酸性時對體系影響較大，而混合液本身的pH值為7，所以本實(shí)驗(yàn)選擇不加緩沖溶液.反應(yīng)時間為5 min ΔF最大，在20 min內(nèi)基本不變，體系比較穩(wěn)定.

2.7 工作曲線及檢出限

取10 mL的比色管，分別依次加入1×10-5mol/L ACH 0 、 0.08、0.2、0.3、0.8、1.0、1.1 、1.2、1.3 、1.4 、1.6 、1.7 mL，再加入CDs 和β-CD溶液各0.1 mL，定容至10 mL，反應(yīng)5 min后，測定各溶液的熒光強(qiáng)度F0和F，并計算ΔF(ΔF=F-F0).結(jié)果見圖11、12.取11支10 mL的比色管，依次加入制備好的CDs 0.1 mL，加蒸餾水稀釋至10 mL，測定熒光強(qiáng)度F，求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)為1.75×10-6mol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.37%，利用3σ/K公式求得檢出限為1.62×10-8mol/L.

圖11 ACH與CDs作用的熒光光譜Fig.11 Fluorescence spectra of CDs with ACH

圖12 ACH 和 ΔF的工作曲線Fig.12 Work curve of ACH and ΔF

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)ACH濃度在0.08～1.6 μmol/L時與ΔF呈良好的線性關(guān)系.繪制工作曲線，其線性回歸方程為ΔF=314.72c+134.54，r=0.997 9.

2.8 干擾離子的測定

2.9 樣品測定

量取5 mL牛奶于25 mL比色管中，加入8 mL的乙腈溶液，震蕩混勻后用超聲波提取，設(shè)定溫度60 ℃，功率為280 W，時間為20 min，抽濾后轉(zhuǎn)移到25 mL離心管中，常溫下沉降蛋白質(zhì)10 min，以1 000 r/min高速離心5 min.平行3次實(shí)驗(yàn)，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率，結(jié)果見表2.

表2 樣品的測定及回收率

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)用花椒為碳源制備了CDs，并探討了制備CDs的最佳條件，以及考察了pH值和時間對CDs穩(wěn)定性的影響.建立了CDs檢測乙酰膽堿的新方法，該方法操作簡便，無毒無害，并且檢出限低.在最佳條件下，該方法的線性為0.08～1.6 μmol/L，線性方程為ΔF=314.72c+134.54,相關(guān)系數(shù)r=0.997 9，檢出限(3σ/K)為1.62×10-8mol/L，并對樣品進(jìn)行了測定，回收率為98%～102%.