武金霞，王琰，譚政浩，劉爽，隋思強(qiáng) ，張賀迎

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002)

紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)屬于真菌界Fung，子囊菌門Ascomycota，散囊菌綱Eurotiomycetes，曲霉目Eurotiales，曲霉科Aspergillaceae，紅曲霉屬(Monascus)[1].紅曲是紅曲霉屬菌株發(fā)酵大米制成，為藥食兩用傳統(tǒng)中藥[2]，紅曲色素是由紅曲霉屬菌株產(chǎn)生的聚酮類混合物[3-5]，主要分為紅、橙、黃3大類，并且色素之間會隨著pH值的變化發(fā)生可逆性轉(zhuǎn)換[6-7]，耐熱性較強(qiáng)，熔點(diǎn)為160～190 ℃[8].紅曲色素作為天然色素，其傳統(tǒng)應(yīng)用多為染色[9-10]，尤其是食品著色[11]，但越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道紅曲色素具有多種生物活性[12]，如抑菌[13]、抗氧化[14]、降血脂[15]以及抑制癌細(xì)胞增殖、促使其凋亡等[16].因此，高產(chǎn)紅曲色素的紅曲霉菌株選育及發(fā)酵研究具有重要意義，是進(jìn)一步開發(fā)紅曲色素的基礎(chǔ).

本研究以微波誘變紫色紅曲霉S1(Monascuspurpureus)，篩選高產(chǎn)紅曲色素的突變株，通過優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件大大提高了其產(chǎn)紅曲色素的水平.

1 材料與儀器

1.1 菌種

紫色紅曲霉S1 (Monascuspurpureus)，本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 培養(yǎng)基

大米豆粕斜面及平板培養(yǎng)基：大米 70 g、豆粕 30 g 于500 mL 水中煮0.5 h，瀝出液體加水至500 mL，添加瓊脂使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，pH 5～6.

種子培養(yǎng)基：大米粉4 g，蛋白胨6 g，硫酸鎂0.4 g，磷酸氫二鉀0.3 g，蒸餾水100 mL.

色素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：大米 20 g 裝入 250 mL 三角瓶中，加水24 mL，封口，于121 ℃滅菌20 min.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

HWS恒溫智能培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)；722 型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-4(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；恒溫智能振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；微波爐；細(xì)胞計(jì)數(shù)器.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 微波誘變

將紫色紅曲霉S1在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長滿孢子，以無菌生理鹽水制備孢子懸液，稀釋至105～106個/mL，分裝至無菌試管中，裝液量5 mL，于微波爐(輸出功率700 W)中進(jìn)行誘變處理0、40、80、120、160、200 s，每處理5 s將試管取出，冰浴去除熱效應(yīng)，誘變時間為微波處理的累加時間.以處理0 s的孢子懸液為對照組，涂布平板培養(yǎng)后計(jì)算致死率.

2.2 菌株的初篩與復(fù)篩

將培養(yǎng)3 d后平板上長出的菌落每4個點(diǎn)接于同一平板上培養(yǎng)，比較平板上菌落的生長情況，從中挑選色素圈較大，且顏色較深的菌落，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，純化.

將初篩菌株接種于種子培養(yǎng)基，32 ℃搖床培養(yǎng) 3 d后，以 5%接種量接種于色素發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng) 12 d，依據(jù) GB4926—2008測量紅曲色素值(以每g干基多少個U表示，即U/g)，比較不同紅曲霉菌株的產(chǎn)紅曲色素能力.

2.3 紅曲霉突變菌株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將復(fù)篩得到的突變菌株連續(xù)傳代 5代，考查其產(chǎn)色素能力是否穩(wěn)定.

2.4 不同基質(zhì)對發(fā)酵的影響

將紫色紅曲霉S1-29分別接種于粳米、香米、糯米為發(fā)酵基質(zhì)的色素發(fā)酵培養(yǎng)基，在32 ℃下發(fā)酵 12 d，測量紅曲色素值，比較其在不同發(fā)酵基質(zhì)上的產(chǎn)紅曲色素能力.

我們離開六渡橋，走進(jìn)一個胡同，再轉(zhuǎn)入一個胡同，彎彎轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，到達(dá)一幢多層樓前。我以為到了地方，一路奔波，我雙膝酸軟，急需休息。李大頭依然領(lǐng)著我們走。我們進(jìn)了一個更為狹小、更為隱秘的胡同。這讓我感覺像是在干什么壞事，比如毒品販子送貨或取貨。幸好我身后還跟著一個王幸福。他的存在，讓我少了恐懼。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 碳源對紫色紅曲霉S1-29發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的影響

在色素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%)和甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%0.5%)，pH自然，32 ℃下恒溫培養(yǎng)12 d.

2.5.2 氮源對紫色紅曲霉S1-29發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的影響

在色素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加酵母粉、蛋白胨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%)和氯化銨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)，pH自然，32 ℃下恒溫培養(yǎng)12 d.

2.5.3 無機(jī)鹽對紫色紅曲霉S1-29發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的影響

在色素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸鋅，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，pH自然，32 ℃下恒溫培養(yǎng)12 d.

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀(A、B、C、D)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，確定不同添加物的最佳復(fù)合配比.

3 結(jié)果與分析

3.1 紫色紅曲霉S1孢子的微波誘變時間的選擇

圖1 不同微波誘變時間對紫色紅曲霉S1孢子的致死率Fig.1 Fatality rate of Monascus purpureus S1 spores in different time of microwave mutagenesis

3.2 微波誘變菌株的篩選

紫色紅曲霉S1經(jīng)紫外線照射200 s后共得菌株1 000株，挑取其中長勢較好的199株點(diǎn)接于平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d，從中挑取9個菌落大、色素圈大的突變株.9個突變株復(fù)篩紅曲色素值結(jié)果見表1.

表1 9株紫色紅曲霉突變株的紅曲色素值

由表1可見，紫色紅曲霉突變株S1-29和S1-192產(chǎn)紅曲色素值較高，較出發(fā)株分別提高57.3%和56.3%.后續(xù)研究以紫色紅曲霉S1-29為實(shí)驗(yàn)對象.

3.3 紫色紅曲霉S1-29的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將紫色紅曲霉S1-29連續(xù)傳代5代，每傳1代都進(jìn)行產(chǎn)色素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，紅曲色素值分別是3 250、3 260、3 160、3 170、3 140 U/g，平均值(3196±55.05)U/g，表明該菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性.

3.4 紫色紅曲霉S1-29在不同基質(zhì)中的產(chǎn)紅曲色素能力

不同種類的米營養(yǎng)成分差別較大，主要區(qū)別在于直鏈淀粉和支鏈淀粉含量不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，紫色紅曲霉 S1-29 在粳米基質(zhì)中產(chǎn)色素能力最強(qiáng).

表2 紫色紅曲霉S1-29在不同基質(zhì)中的產(chǎn)紅曲色素能力

3.5 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5.1 添加不同碳源對紫色紅曲霉S1-29產(chǎn)紅曲色素的影響

以粳米基質(zhì)培養(yǎng)紫色紅曲霉S1-29時，需發(fā)酵12 d紅曲色素值才能達(dá)到最大值.添加葡萄糖和甘油可縮短其發(fā)酵周期到11 d.添加葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時，其紅曲色素值達(dá)到3 360 U/g，添加葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時， 紅曲色素值有所提高，但差異不顯著.添加甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時產(chǎn)紅曲色素值最高，達(dá)3 310 U/g，繼續(xù)增加甘油添加量，紅曲色素值反而降低.結(jié)果見圖2.

A.葡萄糖；B.甘油.

3.5.2 添加不同氮源對紫色紅曲霉S1-29產(chǎn)紅曲色素的影響

添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白胨、酵母粉、氯化銨對紫色紅曲霉S1-29的發(fā)酵周期沒有影響，但均能提高其產(chǎn)紅曲色素水平，其中添加5%蛋白胨時紫色紅曲霉S1-29產(chǎn)色素能力最大，紅曲色素值可達(dá)3 453 U/g，其次為3%的酵母粉(3 356 U/g)以及0.3%的氯化銨(3 322 U/g).結(jié)果提示有機(jī)氮源對其產(chǎn)紅曲色素具有較大的促進(jìn)作用，見圖3.

A.氯化銨；B.酵母粉；C.蛋白胨. 發(fā)酵12 d與發(fā)酵11 d比較： a.差異極顯著(P<0.01);b.差異顯著(P<0.05).

3.5.3 添加不同無機(jī)鹽對紫色紅曲霉S1-29產(chǎn)紅曲色素的影響

圖4結(jié)果顯示，基質(zhì)中添加硫酸鎂和磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.4%時，紫色紅曲霉S1-29產(chǎn)紅曲色素的能力極顯著提高，紅曲色素值可分別達(dá)3 408 U/g和3 360 U/g，添加硫酸鋅能小幅提高色素產(chǎn)量，添加量影響不顯著(圖略).

A.硫酸鎂；B.磷酸氫二鉀. 發(fā)酵12 d與發(fā)酵11 d比較： a.差異極顯著(P<0.01);b.差異顯著(P<0.05);c.差異不顯著.

3.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對紫色紅曲霉S1-29產(chǎn)紅曲色素提高較明顯的4個因素做正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3.

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由直觀分析可知，對于產(chǎn)紅曲色素的影響大小是B>A>C>D，氮源對產(chǎn)紅曲色素影響最大.確定紫色紅曲霉S1-29固態(tài)發(fā)酵的添加物最佳配比為A2B3C1D1，即葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂和磷酸氫二鉀添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為4%、6%、0.4%和0.3%.為考察上述發(fā)酵條件的穩(wěn)定性，按該實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)3次，分別測得紫色紅曲霉S1-29發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素值為4 006、4 013和3 991U/g，平均值(4 003.33±11.24)U/g，說明該條件穩(wěn)定可行.

4 討論

近年來紅曲色素越來越多的生物學(xué)活性被發(fā)現(xiàn)，如何提高紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的水平也成為研究的熱點(diǎn).鄧加聰?shù)萚17]研究發(fā)現(xiàn)添加一定量硫酸亞鐵和維生素B1能提高發(fā)酵紅曲色素值，液態(tài)搖瓶發(fā)酵時紅曲色素值可達(dá)714.80U/mL.Agboyibor等[18]發(fā)現(xiàn)在偏酸性初始pH5.0條件下，以含有10g/L蛋白胨和1.5g/L丙酮酸的培養(yǎng)基發(fā)酵，紅曲黃色素和紅色素可達(dá)(574.76±6.18)U/mL和(570.98±7.66)U/mL.Patrovsky等[19]發(fā)現(xiàn)pH2.5添加8.8g/L蛋白胨可以提高紅曲色素的黃色素和橙色素產(chǎn)量，兩者之和達(dá)1 138mg/L.童愛均等[20]通過響應(yīng)面優(yōu)化在添加果糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)0.54%、氯化銨0.06%和初始含水量46.00%時固態(tài)發(fā)酵得到紅曲紅、橙、黃3種色素之和為6 684.16U/g.

通過紅曲霉育種也能較大幅度地提高紅曲色素產(chǎn)量，如常聰?shù)萚21]采用紫外-氯化鋰復(fù)合誘變方法誘變育種得到紅曲霉菌株QH12，其紅曲紅色素值達(dá)到2 450U/g.Liu等[22]利用等離子體誘變技術(shù)得到紫色紅曲霉菌株M183，固態(tài)發(fā)酵紅曲色素值達(dá)8 460U/g.本研究將微波誘變與固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化相結(jié)合，紫色紅曲霉S1-29產(chǎn)紅曲色素值平均達(dá)4 003U/g.

目前大規(guī)模的紅曲霉發(fā)酵還是以液態(tài)發(fā)酵為主.目前市場上還沒有自動化控制程度較高的固態(tài)發(fā)酵裝置，無論實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，還是生產(chǎn)規(guī)模，多采用篩框進(jìn)行分批固態(tài)發(fā)酵，勞動強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低.與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有無廢水排放、無污染的優(yōu)點(diǎn)，因此研究紅曲霉大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵工藝，如發(fā)酵裝置的改進(jìn)及其自動化控制、通風(fēng)通氧條件優(yōu)化等，對于提升紅曲色素及其他固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)水平具有重要意義.